秸秆腐熟菌剂的细菌种群分析及其腐熟过程的动态研究

摘要

本文以秸秆腐熟菌剂为研究对象,分别采用分子生物学方法和传统平板分离方法对其细菌菌群及在腐熟过程中的变化进行分析.采用构建16S rDNA克隆文库的方法比传统平板分离方法能够更加客观、准确地反应腐熟剂样品中细菌组成,PCR-DGGE技术是目前研究接种微生物在腐熟过程中动态变化的理想方法之一.本文研究可为秸秆腐熟菌剂的菌种合理组成、菌剂生产与应用提供依据. 1.采用构建16S rDNA克隆文库的方法，研究了目前广泛应用的样品A和B的细菌组成。结果表明，样品A主要是融合乳杆菌(Weissella confusa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus);而样品B主要是布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)和耐酸乳杆菌(Lactobacillus acetotolerans).对比平板分离法,采用构建16S.rDNA文库的方法得到的结果更全面,也更好反映出样品中的细菌组成. 2.DGGE分析样品田间应用取样结果表明,堆沤和凼沤这两种发酵方式的优势微生物存在较大的差异.但是都是堆沤方式的两个样品的DGGE图谱则非常相似.目的条带测序结果与产品建库测定结果相比较,测序结果均非所加秸秆腐熟剂B样品的优势细菌. 3.将样品A和B接种水稻秸秆小型堆肥中,采用DGGE的方法和平板培养的方法分析堆肥中的微生物动态变化,并测定堆腐过程中的温度、pH值、含水量、C/N、种子发芽率等参数.实验结果表明,添加秸秆腐熟剂可以促进堆肥顺利进行;堆肥中微生物发生明显演替,首先是乳酸菌和常温细菌大量繁殖,促进堆温升高,进入高温期后高温放线菌和高温细菌快速繁殖,在腐熟后期堆温下降后,常温菌又重新繁殖.采用DGGE图谱分析其过程中优势微生物,结果表明堆腐过程中不同时期是不同优势菌种扮演重要角色以促进秸秆顺利腐熟.并且目的条带测序结果表明,堆肥中优势菌种大多为目前不可培养微生物,并非添加样品中所含优势微生物. 本文的研究结果表明:16S rDNA克隆文库法和DGGE法可以用于微生物菌剂中的细菌组成分析,快速准确检测菌剂质量,这对于微生物菌剂质量的提高,推进微生物肥料行业的可持续发展具有重大意义;堆肥过程是由多个不同菌群主导的接力过程,腐熟剂对初期的腐熟温度的提高起到关键作用,随着腐熟进程的深入,微生物菌群发生了更替.Bead-beader的方法适合大批量DNA的提取.DGGE的方法分析复杂微生物样品需要通过垂直电泳先确定变性剂浓度的大致范围.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

1.1秸秆及其应用现状

1.2秸秆还田与堆肥化处理

1.2.1秸秆堆肥化处理

1.2.2堆肥重要影响因素

1.3秸秆腐熟菌剂研究进展

1.4堆肥中的微生物生态学过程

1.5分子生态学在微生物多样性研究中的应用现状

1.5.1 PCR扩增与多态分析及核苷酸序列分析

1.5.2 DGGE

1.6本论文研究的意义和目的

1.7本论文研究的内容、方法和技术路线

1.7.1本论文研究内容和方法

1.7.2本论文研究所采用的技术路线

第二章16S rDNA克隆文库法分析秸秆腐熟菌剂细菌组成

2.1实验材料

2.1.1秸秆腐熟菌剂

2.1.2主要仪器设备

2.1.3本研究所用的其它菌株、质粒和引物

2.1.4培养基

2.1.5缓冲液和试剂

2.1.6 DNA提取试剂

2.2实验方法

2.2.1总DNA的提取

2.2.2 DNA浓度与纯度的测定

2.2.3 16S rDNA的PCR扩增及PCR产物纯化

2.2.4 PCR产物的连接

2.2.5转化

2.2.6阳性克隆的筛选

2.2.7 ARDRA分型

2.2.8构建克隆文库

2.3结果与分析

2.3.1样品总DNA提取结果

2.3.2 16S rDNA的PCR扩增结果及Reconditioning PCR扩增结果

2.3.3阳性克隆的筛选与检测

2.3.4 ARDRA分型结果

2.3.5构建克隆文库结果

2.3.6两个样品组成菌株的系统发育树状图

2.3.7采用菌落平板计数法测定的样品结果

2.4本章小结

第三章腐熟过程的细菌动态变化研究

3.1实验材料

3.1.1取样

3.1.2主要仪器及试剂

3.2实验方法

3.2.1 DNA的提取方法

3.2.2 16S rDNA的V3区PCR扩增及PCR产物纯化

3.2.3 Reconditioning PCR

3.2.4 DGGE电泳

3.3结果与分析

3.3.1 DNA提取结果

3.3.2 16S rDNA的V3区PCR扩增

3.3.3 Reconditioning PCR结果

3.3.4垂直电泳变性剂浓度的确定

3.3.5三个样品的DGGE分析结果和主要目的条带的测序

3.4本章小结

第四章水稻秸秆的小型堆肥试验

4.1实验材料

4.1.1水稻秸秆和秸秆腐熟菌剂

4.1.2主要仪器和试剂

4.2实验方法

4.2.1堆肥实验处理

4.2.2堆腐过程测定的参数及其测定方法

4.2.3平板计数法分析堆肥微生物

4.2.4堆肥样品DNA提取

4.2.5堆肥样品DGGE图谱

4.3结果与分析

4.3.1原料的基本理化特性

4.3.2堆肥外观效果

4.3.3堆肥各参数变化

4.3.4平板培养法测定堆肥微生物的结果

4.3.5 DGGE分析结果

4.4本章小结

第五章结论与讨论

5.1结论

5.2讨论与展望

参考文献

致谢

作者简历