携带口蹄疫病毒（FMDV）前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

摘要

口蹄疫(Foot-and-mouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)引起的牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性接触性传染病，发病率很高，并能形成大范围流行，给流行的国家和地区造成极大的政治、经济损失。随着分子生物学相关技术在口蹄疫病毒研究中的应用，研究者对口蹄疫病毒基因组结构和功能有了不同程度的了解。其中，口蹄疫病毒的毒性蛋白对于宿主细胞的毒性作用已经成为国内外研究的热点之一。 本研究以O型口蹄疫病毒为研究对象，克隆了O型FMDVOA/58毒株前导蛋白(Lpro)编码基因Lab。利用Swiss-pdbViewer蛋白质分析软件模拟了Lpro的3D模型，发现其功能活性位点可能是第144位的赖氨酸(Lys)、148位的组氨酸(His)和163位的天冬氨酸(Asp)。并且构建了含有Lab基因的重组逆转录病毒载体pBPSTR1-Lab。运用脂质体转染法使该重组质粒与pVSV-G质粒共转染于GP2-293包装细胞中，收集假病毒。通过电镜观察，发现直径约为60nm，外有囊膜，衣壳呈六边形的病毒粒子存在。用假病毒感染牛肾细胞(bovinekidneycell，MDBK)，嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞并且加入四环素抑制Lab基因的表达。通过12天嘌呤霉素的筛选，待抗性克隆形成时，利用有限稀释法挑取单个抗性细胞克隆。将单个抗性克隆分别扩大培养后，经除去四环素诱导整合于宿主细胞基因组中的Lab基因表达，挑选出能在较短时间内使MDBK细胞发生病变的阳性细胞株进行传代培养。利用PCR手段，证实Lab基因被整合到MDBK细胞基因组中，并能稳定地随宿主细胞传代；利用RT-PCR检测手段，证实Lab基因在无四环素的情况下能够被转录。将第35代阳性细胞除去四环素后进行诱导表达，收集均发生病变的细胞，应用Wensten-blotting检测手段鉴定Lpro的表达。结果显示，目的蛋白与O型FMDV抗血清能特异性反应。这表明，目的蛋白具有与O型FMDV感染宿主细胞后产生的Lpro相同的活性。 本试验利用可调控逆转录病毒载体介导基因转移技术，将O型FMDV的Lab基因整合于MDBK细胞基因组中，成功建立了可稳定表达Lpro目的基因的转基因细胞株，为今后研究Lpro。或其他毒性蛋白提供了新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

声明

第一章绪论

1.1研究目的和意义

1.2口蹄疫病毒的概况

1.2.1 FMD历史

1.2.2FMD的流行现状及危害

1.2.3 FMDV的研究进展

1.3 FMDV在细胞凋亡中的研究进展

1.3.1细胞凋亡的发生机制

1.3.2细胞凋亡的两种主要途径

1.4逆转录病毒载体系统的研究进展

1.4.1逆转录病毒载体结构特点

1.4.2逆转录病毒载体系统

1.4.3逆转录病毒表达系统基本原理

1.4.4逆转录病毒载体系统的应用

1.4.5逆转录病毒载体涉及的问题

1.4.6逆转录病毒载体系统的缺陷

1.5研究内容和方法

第二章O型口蹄疫病毒OA/58株Lab基因的克隆及分析

2.1前言

2.2材料与方法

2.2.1实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果

2.3.1目的片段的扩增

2.3.2 pGEM-T Easy-Lab的PCR和酶切鉴定结果

2.3.3序列分析结果

2.3.4 Lpro高级结构的模拟和分析

2.4讨论

第三章携带FMDV前导蛋白基因逆转录病毒载体的构建及其在牛肾细胞中的表达

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.2方法

3.2.1重组表达质粒的构建及鉴定

3.2.2体外转染质粒的制备

3.2.3重组质粒浓度和纯度的测定

3.2.4嘌呤霉素对MDBK细胞最小致死浓度的测定

3.2.5四环素对重组逆转录病毒载体pBPSTR1-Lab的调控浓度

3.2.6转染GP2-293包装细胞并且收获假病毒

3.2.7假病毒形态的电镜观察

3.2.8感染MDBK细胞并抗性筛选阳性细胞

3.2.9目的基因的检测

3.3结果与分析

3.3.1 pBSTR1-Lab重组表达质粒的鉴定

3.3.2重组表达质粒浓度与纯度的鉴定

3.3.3嘌呤霉素对MDBK细胞的最小致死浓度

3.3.4四环素对重组逆转录病毒载体pBPSTR1-Lab的调控浓度

3.3.5假病毒的获得

3.3.6假病毒粒子的形态观察

3.3.7抗性MDBK细胞的筛选

3.3.8目的基因整合和转录水平的检测

3.3.9Lab基因表达产物的Western-blot检测

3.3.10诱导前导蛋白表达的显微镜观察结果

3.3.11野生型逆转录病毒的检测

3.4讨论

第四章研究结论

参考文献

致谢

作者简历