斯氏假单胞菌A1501的功能基因组学研究：“固氮岛”的鉴定、环境适应性及铵冲击条件下的表达谱分析

摘要

斯氏假单胞菌A1501(菌种保藏号CGMCC0351)于1980年分离自中国南方稻田，最初定名为粪产碱菌。该菌在低铵浓度和微好氧条件下具有良好的固氮能力。该菌不仅能够在土壤中生存，而且可以定植于植物根表甚至侵入植物组织。以A1501为出发菌株开发的植物促生菌在中国已被广泛应用。A1501菌全基因组序列的破译对于我们理解生物固氮的进化和A1501菌根表联合体系中的竞争机制非常重要。A1501菌基因组是一个长度为4567418bp的环状染色体，没有发现质粒。在该菌基因组编码的4146个基因中，大约2000个基因可以在其他5株已完成基因组测定的假单胞代表菌中找到同源基因。 A1501菌所有固氮相关基因都分布在一个49kb的DNA区域，该区域编码了59个基因。这49kb区域的G+C含量与基因组平均的G+C含量有着明显差异。这些特征暗示了49kb的nif基因编码区可能是一个固氮的“基因岛”。在该基因岛中，一些新发现的基因穿插在传统的固氮基因之间，而且与nif基因形成转录上紧密的操纵单元。通过转录组学分析及突变株构建，12个新基因被认为与A1501菌最佳固氮酶活的实现紧密相关。A1501菌基因组分析还揭示了该菌广泛利用多种碳源、反硝化以及应付环境胁迫的遗传基础。A1501菌的根部定植涉及到趋化、菌毛、鞭毛等多种因素。在A1501菌中，编码信号转导途径的基因有44个，另外还鉴定了3个编码鞭毛合成的基因簇，6个编码Ⅳ型菌毛的基因簇。 为了研究在不同的氮源供给情况下A1501菌的基因表达情况，同时探索固氮基因的表达调控机制及氮信号在细胞内的传递过程，我们构建了A1501菌的全基因组芯片。与氮过量条件相比，在固氮条件(氮匮乏)下，549个基因的表达发生了明显的变化，其中255个基因表达上调，294个基因表达下调。固氮岛内大部分基因、可替代氮源转运系统、参与反硝化、无氧呼吸及固氮酶的氧保护的基因在固氮条件下表达显著上调，而参与细胞转录与翻译、物质代谢、能量合成的基因固氮条件下表达受到明显抑制。采用20mM铵冲击固氮体系，在冲击处理后2分钟的时间点取样，有120个基因的表达明显下调，其中包括几乎所有的固氮基因及已知氮调控基因。33个编码调控蛋白、信号转导及膜蛋白的基因在铵冲击后表达量剧烈下调，其中有8个基因编码属于sigma-54依赖型的蛋白，表明这些基因可能都参与了氮代谢调控，另有3个基因编码信号转换蛋白，这3个基因是否与细胞内氨信号的转运相关需要进一步的试验证明。在铵冲击10分钟和30分钟时间点取样表明，随着冲击处理的时间延续，基因表达逐渐恢复，细胞的生理功能逐渐从固氮状态恢复到氮源旺盛的生长状态。

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第一章综述：生物固氮基因表达调控研究进展及基因芯片技术在基因表达谱研究中的应用

1.1固氮酶结构及其装配过程

1.2固氮基因的表达调控

1.2.1NifLA对固氮基因的调节作用

1.2.2ntr及gln系统对固氮基因的调节作用

1.2.3固氮酶的翻译后调节：DraT-DraG调节系统

1.3 DNA芯片技术在基因表达研究中的应用

1.3.1大肠杆菌基因表达谱的研究

1.3.2表达谱技术鉴定病原菌的致病相关基因

1.3.3表达谱技术研究细菌的碳-氮代谢调控机制

1.4水稻根际联合固氮的意义及斯氏假单胞A1501的研究现状

1.5本研究的立题依据

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株及载体

2.1.2工具酶及DNA分子量标准

2.1.3试剂盒

2.1.4主要化学试剂及材料

2.1.5主要仪器及设备

2.1.6溶液和培养基

2.2实验方法

2.2.1细菌的培养

2.2.2固氮酶活测定

2.2.3染色体DNA的提取

2.2.4芯片探针的制备

2.2.5芯片的后期处理及存放

2.2.6细菌总RNA的提取

2.2.7cDNA的反转录合

2.2.8cDNA的纯化

2.2.9基因组DNA与cDNA探针的荧光标记

2.2.10芯片杂交与洗涤

2.2.11芯片扫描及数据处理

2.2.12荧光实时定量PCR验证

2.2.13突变株构建策略

第三章斯氏假单胞菌A1501基因组学分析及“固氮岛”内新基因的鉴定

3.1结果与分析

3.1.1基因组基本特征及比较基因组学

3.1.2“固氮岛”的发现及新固氮基因的鉴定

3.1.3A1501根际竞争特性的基因组学分析

3.1.4A1501根部定植及植物促生作用

3.2讨论

第四章斯氏假单胞菌A1501在铵抑制及铵冲击条件下的基因表达谱分析

4.1A1501全基因组芯片的制备

4.2A1501菌培养时相的选择

4.3固氮条件与铵抑制条件下基因表达谱概述

4.4氮代谢及氨基酸合成相关基因的表达情况

4.5生物固氮及氮代谢的全局性调控机制

4.6呼吸作用及固氮酶的氧保护

4.7固氮条件下表达上调的其他基因

4.8固氮条件下表达下调的其他基因

4.9氨冲击对A1501固氮体系及基因表达谱的影响

4.10讨论

参考文献

致 谢

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