Luciferase报告基因禽流感病毒小基因组的构建及其在病毒聚合酶功能研究中的应用

摘要

H5N1亚型禽流感的暴发给世界养禽业造成毁灭性打击，而且“97香港禽流感事件”及东南亚陆续发生的暴发禽流感并再次导致数人感染致死充分证明，H5亚型高致病性禽流感对人类公共卫生构成巨大潜在威胁。H5亚型高致病性禽流感病毒如何跨越禽—哺乳动物宿主种间屏障，仍是一个重大课题。 通过反向遗传技术证实DKGX22、DKGX35毒株对哺乳动物致病性的差异是由于PB2基因引起，但PB2基因究竟在病毒对哺乳动物致病性的那个环节影响流感病毒的感染性仍不清楚，本实验针对这一点进行研究。 实验利用反向遗传操作系统，在真核细胞中构建DKGX/35/01，DKGX/22/01两毒株聚合酶蛋白复合体(RNPs)。萤光素酶报告基因载体同双向转录pBD质粒pBD-PB1、pBD-PB2、pBD-PA、pBD-NP共转染，通过检测荧光活性值报告病毒聚合酶复合体的活性。荧光检测证实在293T细胞中可以构建出有活性的流感病毒聚合酶复合体。 通过单个基因替换，构建DKGX/35/01聚合酶复合体背景的重组复合体和DKGX/22/01聚合酶背景的重组复合体，通过荧光检测证实，PB2基因是导致流感病毒聚合酶复合体活性不同的关键基因；两两替换转染中病毒聚合酶复合体的基因片段，双基因替换结果显示凡是含有DKGX/22/01的PB2基因的组合，聚合酶活性显著降低：通过点突变基因替换证实，PB2蛋白的699位点和701位点都可以改变流感病毒聚合酶复合体的活性，但以701位点影响最大。 实验结果证实，PB2基因对流感病毒聚合酶复合体活性影响与对应的流感病毒对哺乳动物致病性影响相符合。由遗传规律可知，DNA-蛋白质-蛋白质功能-生物活性：在PB2基因影响流感病毒致病性方面，首先影响了流感病毒聚合酶复合体的活性，进一步导致流感病毒对哺乳动物的致病性显著不同。

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第一章引言

1.1禽流感病毒分子生物学特性

1.1.1禽流感病毒的组成和复制

1.1.2禽流感病毒致病性的分子基础

1.1.3流感病毒跨宿主传播的分子基础

1.2反向遗传操作技术及其在流感病毒研究中的应用

1.2.1反向遗传学和反向遗传技术的发展过程

1.2.2流感病毒反向遗传技术的应用

1.3萤光素酶报告基因及应用

1.3.1萤光素酶的性质和发光原理

1.3.2萤光素酶的测定

1.3.3萤光素酶作为报告基因的应用

1.3.4双萤光素酶检测法

1.4本研究的目的和意义

第二章 萤光素酶报告基因载体的构建及对流感病毒聚合酶复合体活性检测

2.1材料

2.1.1.质粒、细菌和细胞

2.1.2主要试剂和仪器

2.2方法

2.2.1 pPolI-Luci-T载体的构建

2.2.2双萤光素酶报告基因检测流感聚合酶复合体的活性

2.3结果

2.3.1 pPolI-T空载体Lgu I酶切及处理

2.3.2 NP5'-Luciferase-NP3'的扩增及PCR鉴定

2.3.3报告基因载体pPolI-Luci-T的克隆

2.3.4.单基因替换聚合酶活性检测

2.3.5双基因替换聚合酶复合体活性检测

2.3.6聚合酶复合体PB2蛋白点突变替换活性检测结果

2.4讨论

第三章结论

参考文献

附录

致 谢

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