RNAi转基因植物基于DNA的快速精确检测方法研究

摘要

RNAi技术在转基因植物上的应用越来越广,包括已经允许商业化生产的转基因植物中,但目前对RNAi转基因植物的快速精确检测技术相对滞后。本研究的目的在于建立基于DNA的RNAi转基因植物快速精确的检测体系,实现对RNAi转基因植物的有效检测,弥补现有转基因检测技术的不足。检测体系的建立主要基于探针的制备、多重PCR、全基因组扩增、基因芯片杂交技术及PCR产物的变复性电泳等几个方面。
　　 关于探针的制备,首先通过查阅大量文献搜集并整理了RNAi转基因事件中常用转基因元件37个,包括启动子14个,终止子4个,选择标记基因5个,报告基因2个和内含子12个。根据上述转基因元件的保守序列设计引物,PCR扩增获得点制芯片的探针。同时设置阳性、阴性和空白对照用于后期芯片杂交实验的质量监控。其中阳性对照为真核生物中普遍存在的18S rDNA,阴性对照为野猪肝脏中表达的一个基因,空白对照为不含任何核酸的点样液。探针经PCR方法扩增获得,扩增产物纯化定量后用于点制基因芯片。
　　 本研究搜集了8种植物样品作为检测对象,包括4种RNAi转基因水稻,2种普通转基因植物,1种转空载体的对照转基因水稻,1种野生型水稻。提取上述样品的基因组DNA,取一部分样品进行多重PCR扩增,扩增产物与芯片杂交；另一部分样品进行全基因组扩增,获得足够杂交的样品并经片段化处理后与芯片杂交。
　　 本研究优化了多重PCR体系及基因组片段化体系,获得了适用于芯片杂交的样品。开展了样品OsBTF3,OsCtBPA,R1和pTCK303的多重PCR产物与芯片杂交实验:以及OsCtBPA基因组样品与芯片杂交实验。两种样品处理方式的杂交结果显示:多重PCR样品与芯片杂交后检测到强烈的转基因元件的信号,基因组样品与芯片杂交检测到阳性对照、水稻基因组元件及转基因元件的信号。芯片杂交实验取得成功,其结果可用于下一步实验。但结果中存在一些假阳性,因此芯片杂交实验有待进一步完善。
　　 本研究以样品OsCtBPA为例,根据两次芯片杂交实验中检测到的启动子和终止子设计引物,扩增转基因目的片段,根据RNAi结构的特点,利用变复性电泳实验进行了检测验证。结果表明,扩增得到的RNAi转基因目的片段,变复性后条带位置的确发生了变化,而转空载体的对照则没有,说明变复性电泳实验是可行的。本研究下一步将对其它样品进行检测。
　　 本研究经过对探针制备、样品准备、芯片点制、芯片杂交和变复性电泳等实验体系的摸索和优化,初步建立了依据DNA来检测鉴定是否为RNAi转基因植物的技术体系,可以用于对RNAi转基因植物进行检测,对RNAi转基因植物的规范管理具有十分重要的意义。