绵羊DSG4基因的结构、遗传多样性、育及重组特性

摘要

线粒体DNA(mtDNA)研究结果显示，家养绵羊(Ovis aries)可能具有5个母系起源，至于父系起源的具体数量，目前尚不清楚。为了进一步阐明家养绵羊的遗传背景，本研究采用28对PCR引物和95条测序引物，分析了17只国内外绵羊的桥粒芯糖蛋白4(Desmoglein4，DSG4)基因的41 kb全长序列，应用邻接法并基于Kimura-2双参数模型构建系统发育树，同时应用MEGA4.0和DnaSP5.0软件对DSG4基因单倍型间的遗传变异进行了分析；进一步测定了8个国内品种和4个国外品种、共计450只绵羊的DSG4基因635 bp的高变区序列(14427-15061)，利用Arlequin3.1软件统计单倍型的频率、进行HWE检验和AMOVA分析，并利用DnaSP5.0软件计算单倍型多样度及进行一系列的中性检验，同时利用Network构建了中介网络图，获得如下结果：
　　 1.通过对基因组DNA和cDNA序列分析表明，绵羊DSG4基因的DNA总长度为41 kb，由16个外显子和15个内含子组成，CDS长3123 bp，外显子的大小在36～765 bp之间，内含子的大小在268～12118 bp之间。
　　 2.从17条DSG4基因41 kb全长序列推导出20个单倍型，其中有648处变异位点，包括582个SNPs和66个插入/缺失(indel)，其中转换437处，颠换145处，转换与颠换的比值为3.01，平均每1 kb序列有14个SNPs；10个碱基以上的indel有8处，最长的indel含69个碱基。在编码区共发现35处变异，包括34个SNPs和1个TTG indel，其中11个SNPs和TTG indel引起氨基酸改变，Polyphen预测第785、891、904和1018位的氨基酸替换很可能会影响DSG4蛋白质的结构和功能。
　　 3.通过对DSG4基因20个全长单倍型的两两比较，基于大量变异的分布特点，确认了该基因内有多次重组(Crossovers)，并且几乎都分布在15～20 kb区域内，因而推断绵羊DSG4基因内存在重组热点(Recombination hotspot)。
　　 4.20个单倍型的前15 kb序列可聚为8个不同的单倍型类群，类群间的遗传变异在21处至144处之间，平均为89处(未计indels)，而类群内的单倍型两两相比至多只出现4处变异，表明家养绵羊可能具有8个不同的遗传背景。
　　 5.635 bp序列中共有22个SNPs和21个单倍型，其中h1至h10与全长单倍型H1至H10一致；h1为主单倍型、总的频率达0.493，在国外绵羊中优势更为明显；h2在我国绵羊中总的频率达0.194，在8个品种中都有分布、频率在0.036～0.397之间，但在120只国外绵羊中没有出现；h6在我国绵羊中的频率为0.074，仅次于h1(0.424)和h2(0.194)，在国外绵羊中也没有出现；h3至h10总的频率在0.026～0.056之间；h11至h21只在我国绵羊出现、但频率极低，总的频率在0.001～0.008之间。我国绵羊含有21个单倍型，国外绵羊只有8个，而且我国绵羊的单倍型多样度(Hd)明显高于国外绵羊(0.766 vs0.514)。对于8个国内品种，藏羊的Hd最高(0.846)，其次是多浪羊(0.767)、滩羊(0.748)和小尾寒羊(0.747)比较接近，湖羊的Hd最低(0.451)。
　　 6.藏羊有3个SNPs位点的基因型分布显著偏离HWE(P<0.05)，而所有22个SNPs在其它11个国内外绵羊品种中均符合HWE。AMOVA分析结果显示，品种间的变异程度不高，变异主要来源于品种内。DnaSP5.0软件分析结果显示，绵羊DSG4基因635 bp序列显著偏离中性选择。构建了21个单倍型的系统发育树，结果显示h12可能来自一个新的遗传背景，结合中介网络分析的结果推断部分稀有单倍犁可能是由重组产生。
　　 DSG4基因具有8个不同的单倍型类群，暗示家养绵羊可能还含有不同于母系遗传背景的父系来源。测定了9个中国品种和2个伊朗品种、共计152只公绵羊的性别决定基因(Sex determiningregion Y，SRY)部分序列，继而采用PCR-RFLP方法筛查了2个SNPs(其中460G>T为新发现)在另外226只国内外绵羊中的多态性，结果显示：152条SRY序列与GenBank中已有的盘羊(Ovisammon)和羱羊(Ovis vignei)等野生近缘种的都不相同；88A>G的G等位基因在我国绵羊(n=322)只出现2例，在无角道赛特(n=10)、萨福克(n=5)和特克赛尔(n=10)中已被固定；而460G>T的T等位基因在新疆和田羊(n=20)和滩羊(n=45)中的频率分别为0.10和0.16，在其它22个国内外品种中都没有出现。鉴于我国西北地区分布着多个盘羊亚种，我们推断新疆和田羊和滩羊具有独特的父系来源，并且可能是来自于野生盘羊的基因渗入。