克服水稻Xa32基因抗性的黄单胞杆菌Tn5-突变体的筛选及无毒基因鉴定

摘要

水稻白叶枯病是世界水稻生产中最重要的细菌性病害之一,白叶枯病细菌.水稻的互作是研究病原菌-植物互作的模式系统。寄主粳稻日本晴、籼稻9311以及白叶枯病原菌株。PX099、KACC、MAFF基因组测序已经完成,使水稻白叶枯病成为一个寄主和病原菌基因组都已经测序的重要农作物病害,为深入探究病原菌与寄主的分子互作提供了重要的生物信息基础。
　　 无毒基因作为与寄主互作的重要因子,决定着病原菌与寄主互作时的亲和反应与非亲和反应:在含有相应的抗病基因植株上表现为非亲和反应,而在感病植株中表现为亲和反应。研究植物抗病基因对应的无毒基因,有利于揭示病原菌与寄主分子互作的细节,阐明寄主的抗病分子机制,对水稻抗病育种具有重要意义。
　　 本实验室前期发掘的Xa32是一个来源于野生稻的抗病谱广、显性、全生育期抗性的抗白叶枯病基因。本研究筛选Xa32对应的自叶枯病菌无毒基因突变体,对于研究Xa32基因的抗病机制具有重要的意义。目前为止克隆得到的白叶枯病菌无毒基因均为TAL effector家族基因,因此,获得PX099中 TAL effector基因的相邻基因并对其功能进行整理和预测,有利于了解 TAL effector在PX099中的分布,并结合侧翼序列分析的结果进行预测。
　　 为获得avrXa32,本研究对PX099的Tn5-突变体库进行了大规模的接种筛选,对突变体菌进行了分子鉴定,分离了突变体插入位点的侧翼序列并进行了生物信息学分析,获得的结果如下:
　　 1.利用人工剪叶接种法,在水稻导入系C4064(含有Xa32)上,大规模接种PX099的Tn5-突变体库,筛选使C4064致病的突变体菌株。初筛中,每个菌株接种1个植株,获得了122个候选致病突变体菌株；复筛中,每个菌株接种C4064植株2株,并以感病品种JG30做对照,最终确认6个能够克服Xa32抗性的致病突变体菌,编号为KXM2、KXM12、KXM22、KXM24、KXM66和KXM71。
　　 2.对获得的突变体菌,进行了分子检测。利用PCR的方法检测了初筛获得的122个使C4064感病的候选突变体菌株,以野生型菌PX099为对照,发现突变体中均能扩增出Tn5的目的条带,表明致病突变体是由Tn5插入引起的。利用Southern杂交的方法检测了复筛确认的6个突变体菌的Tn5拷贝数,发现只有KXM22为双拷贝插入,其余均为单拷贝插入。
　　 3.利用PCR.Walking的方法分离并获得了其中4个突变体菌Tn5插入位点的侧翼序列。利用生物信息学的办法对插入位点突变的基因进行分析。通过与NCBI比对,获得了4个突变体菌株插入位点侧翼序列的比对信息,KXM2、KXM12、KXM22、KXM71插入位点分别编码ISX006transposase,Na+symporter,ISX08 Transposase和乙酰胞壁酸脱氢酶与腺苷酸激酶之间序列。
　　 4.通过基因组信息获得了PX099中各 TAL effector基因座相邻的基因及功能,发现TALeffector基因座的两边存在显著的遗传学特征,如插入元件、transposases和噬菌体相关的整合酶等。转座子和插入元件的广泛分布可能有利于TAL effector基因在细菌中拷贝数的增加和重排,导致基因组的扩增,引起小种致病性的分化。而本研究获得的KXM2和KXM22突变体也是ISX006 transposase,ISX08 Transposase编码基因位点的变化,可能导致插入位点下游的 TALeffector基因的变化,致使该突变体在C4064上表现出致病性。