对华北大黑鳃金龟幼虫具有活性的苏云金芽胞杆菌筛选与鉴定

摘要

华北大黑鳃金龟[Holotrichia oblita(Falderman)]是难以防治的地下害虫，给农作物造成严重的损失。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是一种已被广泛用于农业害虫防治的昆虫病原微生物，其在芽胞形成期可产生主要由cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白。发掘Bt菌株资源是实现此类害虫绿色防控的重要手段，因此，为了获得对华北大黑鳃金龟具有较高杀虫活性的菌株，本研究以实验室分离的500株Bt菌株材料为基础，通过杀虫活性测定筛选对华北大黑鳃金龟幼虫有活性的菌株，进一步对菌株多样性分析、菌株晶体形态观察和蛋白表达分析、基因鉴定和华北大黑鳃金龟幼虫感染Bt后中肠组织病理切片等方面进行了一系列的研究，其主要结果如下:
　　对华北大黑鳃金龟幼虫有活性菌株的筛选:以实验室分离的500株Bt菌株为材料，通过杀虫活性测定筛选到了42株对华北大黑鳃金龟幼虫具有不同程度活性的菌株，其中有10株14天的校正死亡率大于60％，而261-1菌株7天校正死亡率就达到100％，其余菌株的14天校正死亡率在30‰60％之间。
　　菌株多样性分析:利用本实验室建立的便捷的Bt菌株比较鉴别技术，对这42株菌株进行多样性分析，以42株菌株的基因组为模板，利用优化后的简并引物和PCR扩增体系进行扩增，并利用Hinfl对PCR产物进行酶切，通过电泳分析获得了33个菌株的RFLP图谱，分析比较显示它们属于14个不同的菌株类型，从而有效的去除了冗余菌株，结合菌株对华北大黑鳃金龟的杀虫活性数据，选择1126-1、P65-1、QDL47-1、261-1、FTL84、78-2、127-2、78-3、1198-1、S10A2、B8E12、QDL40-2、FCD114、B8E11等14株Bt菌株进行进一步鉴定。
　　菌株晶体形态观察和蛋白表达分析:通过对14株Bt菌株的晶体形态电子显微镜观察，结果显示，78-3、127-2和1198-1菌株能产生双锥体型晶体;261-1、FCD114、P65-1、FTL84、78-2和1126-1菌株能产生球形晶体，而其它5个菌株没有晶体存在。通过SDS-PAGE分析了14株代表菌株表达蛋白情况，结果显示菌株P65-1、1126-1、127-2、78-3、261-1、FCD114、1198-1和78-2能表达典型的约130 kDa的Bt Cry蛋白，QDL47-1和B8E11表达了约97 kDa蛋白，其余菌株表达了少量60 kDa的蛋白。
　　cry基因鉴定:利用cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43类通用引物对14株Bt菌株进行进一步基因鉴定，结果显示这14个菌株中，只有P65-1、1126-1、FCD114和78-2四个菌株分别含有cry8Ma、cry8Ca、cry8Ab、cry8Ga、cry8Ea等5类cry8类新基因;而包括对华北大黑鳃金龟幼虫活性最高的261-1菌株在内的其它10个菌株均不含有cry3、cry8、cry18、cry23、cry37、cry43等对鞘翅目害虫有效的杀虫基因。质谱鉴定结果也显示了P65-1、1126-1、FCD114和78-2等菌株有Cry8类蛋白的表达。
　　中肠组织病理学观察:进一步通过对华北大黑鳃金龟幼虫感染Bt后中肠组织病理切片的观察，发现在感染菌株261-1、1198-1、FCD114、1126-1、QDL40-2后，幼虫肠壁细胞组织有明显的病理变化。
　　本研究结果对防治大黑鳃金龟的Bt菌株和杀虫基因资源发掘均具有重要意义。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 苏云金芽胞杆菌概述

1．2 Bt毒素命名与分类

1．3 杀虫晶体蛋白结构与功能以及作用机制

1．3．1 Cry毒素(δ-endotoxin)

1．3．2 Cyt毒素

1．4 Bt杀虫基因鉴定方法

1．4．1 构建DNA文库鉴定

1．4．2 以PCR为基础的方法

1．4．3 基因组测序

1．4．4 分子杂交和基因芯片鉴定

1．5 蛴螬及其危害

1．5．1 蛴螬的危害

1．5．2 大黑鳃金龟及其防治

1．6 苏云金芽胞杆菌的应用

1．6．1 Bt杀虫剂

1．6．2 转Bt基因植物

1．7 本研究的立题依据和目的意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 培养基

2．1．3 抗生素

2．1．4 酶与生化试剂

2．1．5 常用溶液与缓冲液

2．1．6 供试昆虫

2．1．7 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 Bt菌株生物活性的测定

2．2．2 Bt基因组DNA的提取

2．2．3 PCR扩增(多样性分析)

2．2．4 酶切反应(RFLP-PCR分析)

2．2．5 菌株晶体的形态观察

2．2．6 杀虫晶体蛋白的分析

2．2．7 杀虫晶体蛋白基因的鉴定

2．2．8 Bt蛋白的提取

2．2．9 分泌蛋白的浓缩

2．2．10 DNA回收

2．2．11 DNA片段的连接

2．2．12 大肠杆菌感受态的制备与转化

2．2．13 琼脂颗粒的制备

2．2．14 华北大黑鳃金龟幼虫的室内饲养

2．2．15 琼脂体系中华北大黑鳃金龟幼虫的饲养与生物活性测定方法

2．2．16 华北大黑鳃金龟幼虫中肠切片观察

2．2．17 饲喂Bt后华北大黑鳃金龟幼虫肠道微生物的观察

第三章 结果与讨论

3．1 结果与分析

3．1．1 对蛴螬有活性的菌株筛选

3．1．2 Bt菌株多样性分析

3．1．3 Bt菌株晶体形态观察

3．1．4 Bt菌株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析

3．1．5 Bt菌株基因型的初步分析

3．1．6 Bt菌株杀虫蛋白基因型的初步分析

3．1．7 Bt菌株杀虫蛋白质谱鉴定

3．1．8 大黑鳃金龟幼虫室内饲养

3．1．9 琼脂体系中大黑鳃金龟幼虫的饲养

3．1．10 菌株杀虫活性分析

3．1．11 中肠病理切片观察

3．1．12 饲喂Bt后大黑鳃金龟幼虫肠道微生物的观察

3．2 讨论

全文结论

参考文献

致谢

作者简历