禾谷孢囊线虫新效应因子Ha-G20E03基因克隆及用于研究其功能的新模式系统的探索

摘要

禾谷孢囊线虫是世界上广泛分布的一种重要植物病原，给小麦粮食生产安全造成了严重威胁。植物线虫通过其口针向寄主植物细胞分泌效应子蛋白，从而促进线虫寄生和引起植物致病。但是迄今为止，有关于禾谷孢囊线虫效应子分子机制研究还十分肤浅，这主要是因为其研究缺乏一个合适的病害系统。
　　本实验首先基于转录组文库数据，利用RACE法克隆一个推定效应子基因cDNA全长。该基因全长837bp，其中包含一个585bp的开放阅读框，编码194个氨基酸，在N端拥有一个21个氨基酸的信号肽，且不含跨膜结构域。通过BLAST比对发现，该基因与大豆孢囊线虫G20E03拥有90％的同源性，因此我们将其命名为Ha-G20E03基因。通过原位杂交实验，Ha-G20E03基因在禾谷孢囊线虫食道腺细胞中特异性表达，可能在禾谷孢囊线虫寄生过程中起到重要作用。
　　为了更好的研究该基因的功能，本实验选取了二穗短柄草，二倍体小麦2A和2D作为候选的禾本科模式植物，希望建立用来替代小麦来研究禾谷孢囊线虫和其寄主互作分子机制的模式系统。通过禾谷孢囊线虫接种实验，活性氧ROS含量检测，qRT-PCR，植物根部组织组织学分析，大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默(BSMV-VIGS)在候选禾本科植物上的应用等技术检测了禾谷孢囊线虫与3种候选禾本科模式植物的亲和性，并对非亲和寄主分析可能原因，以及对亲和寄主进行了接下来的沉默实验。研究结果表明:禾谷孢囊线虫可以侵入到Bd21-3根部，但不能完成其生活史，并发现这种非亲和性并不依赖于禾谷孢囊线虫种群差异。此外，我们在接种禾谷孢囊线虫后3天的二穗短柄草根组织中观测到强烈的ROS迸发，并发现在这个时间点有7个第三类氧化酶基因和2个NADPH氧化酶基因表达显著上调。随后，我们发现禾谷孢囊线虫可以在二倍体小麦2A(G1812)和2D(AL8/78)中正常发育，完成生活史，且发育进程、各虫态所占比例与对照基本上一致。解剖学结果表明2D中的合胞体细胞稍小，2A中合胞体发育正常。在孢囊形成上，2A和对照的单株孢囊数相当，而2D的单株孢囊数稍低。在实验室中，在小麦上建立大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默体系，成功将小麦靶标基因PDS沉默，出现光漂白现象，并确定了沉默效果最好的小麦品种济麦22作为实验室今后VIGS相关实验寄主小麦。在二倍体小麦2A上建立大麦条斑花叶病毒诱导的基因沉默体系仍然在构建中。
　　本研究克隆了Ha-G20E03基因，并明确其在禾谷孢囊线虫食道腺细胞中特异性表达。本实验还明确了二穗短柄草是禾谷孢囊线虫非寄主，无法作为与禾谷孢囊线虫互作的模式寄主，并认为ROS迸发是其不亲和性重要原因之一，POX基因可能在其中起到关键作用。而二倍体小麦2A和2D均与禾谷孢囊线虫亲和，2A对禾谷孢囊线虫更敏感，有更大的可能性作为研究禾谷孢囊线虫和其寄主互作的模式寄主。本实验结果将为禾谷孢囊线虫与寄主互作分子机制奠定基础。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物寄生线虫

1．2 禾谷孢囊线虫及其危害

1．2．1 孢囊线虫简介

1．2．2 小麦禾谷孢囊线虫及其危害

1．3 推定效应子基因G20E03研究进展

1．3．1 植物线虫效应子研究进展

1．3．2 推定效应子基因G20E03研究进展

1．4 禾本科模式作物研究进展

1．4．1 目前主要禾本科模式植物

1．4．2 二倍体小麦2A和2D

1．4．3 应用于植物线虫与寄主互作的模式平台

1．5 病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究进展

1．5．1 VIGS技术的建立、发展与应用

1．5．2 大麦条斑花叶病毒(BSMV)诱导的基因沉默

1．6 研究目的及意义

1．6．1 目的

1．6．2 研究意义

第二章 禾谷孢囊线虫Heterodera avenae推定效应子基因G20E03的克隆与定位分析

2．1 实验材料

2．1．1 供试禾谷孢囊线虫

2．2 禾谷孢囊线虫G20E03基因的全长克隆和定位分析

2．2．1 禾谷孢囊线虫G20E03基因的全长克隆

2．2．2 禾谷孢囊线虫G20E03基因的原位杂交

2．3 结果与分析

2．3．1 禾谷孢羹线虫G20E03基因cDNA全长克隆

2．3．2 禾谷孢囊线虫G20E03基因序列分析

2．3．3 禾谷孢囊线虫G20E03基因原位杂交

2．4 讨论与小结

第三章 禾谷孢囊线虫Heterodera avenae对不同禾本科寄主的侵染研究

3．1 实验材料

3．1．1 供试禾谷孢囊线虫

3．1．2 候选的禾本科寄主植物

3．2 禾谷孢囊线虫对二穗短柄草和二倍体小麦的侵染实验

3．2．1 温室接种方法

3．2．2 染色方法

3．2．3 根组织内线虫形态观察和数量统计

3．2．4 植物根组织内ROS含量的测定

3．2．5 ROS产生相关基因的定量分析

3．2．6 植物根组织中禾谷孢囊线虫诱导的合胞体组织学分析

3．3 结果与分析

3．3．1 禾谷孢囊线虫对二穗短柄草的侵染实验

3．3．2 二穗短柄草根组织中ROS含量测量和ROS产生基因表达分析

3．3．3 禾谷孢囊线虫对二倍体小麦2A和2D的侵染实验

2．4 讨论与小结

第四章 大麦条斑花叶病毒(BSMV)诱导二倍体小麦2A基因有效沉默体系的探索

4．1 实验材料

4．1．1 供试植物二倍体小麦2A

4．1．2 BSMV病毒载体

4．1．3 本氏烟

4．2 大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系在二倍体小麦2A的探索

4．2．1 本氏烟种植和培养

4．2．2 BSMV质粒的提取

4．2．3 农杆菌感受态细胞的制备

4．2．4 农杆菌感受态细胞的转化

4．2．5 BSMV诱导的基因沉默其过程

4．2．6 实时定量PCR(Real-Time PCR)检测

4．3 结果与分析

4．3．1 适合大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系的小麦品种筛选

4．3．2 大麦条斑花叶病毒诱导基因沉默体系在二倍体小麦2A上的探索

4．4 讨论与小结

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历