小麦矮缩病毒实时荧光定量PCR体系在小麦和异沙叶蝉中的建立与应用

摘要

小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）属于联体病毒科玉米线条病毒属，通过异沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)介体以持久循回性方式传播，小麦矮缩病害的发生与传播与WDV、异沙叶蝉介体以及小麦寄主之间的互作息息相关。这种互作涉及三者相关基因的表达。已有研究表明，联体病毒科的病毒粒子在植物细胞间的运输需要病毒的衣壳蛋白(Coat Protein，CP)，它辅助运动蛋白(Movement Protein，MP)调控胞间连丝的转运能力，同时，WDV的CP蛋白参与WDV与异沙叶蝉之间的互作。为准确、相对定量地分析WDV相关基因在小麦和介体的表达，本实验分别构建了WDV在小麦和异沙叶蝉体内的RT-qPCR体系。
　　(1)选择小麦的5个持家基因TEF-1-α、GAPDH、18SrRNA、UBC和28SrRNA作为内参基因，以3种统计分析软件Genorm、NormFinder和Bestkeeper分析内参基因在小麦茎和叶两种组织中的表达稳定性。小麦茎中，TEF-1-α最稳定，而28SrRNA最不稳定。小麦叶中，由于三种软件结果不一致，很难确定最稳定和最不稳定的内参基因。但是，小麦茎、叶中最稳定的内参基因组合都是TEF-1-α和GAPDH。同时，由Genorm软件计算内参基因之间的配对变异Vn/Vn+1，判断茎和叶组织中用于标准化的最优内参基因数目至少5个。
　　(2)利用建立好的体系检测了WDV-CP基因在小麦茎、叶两种组织中的相对表达量，结果显示WDV-CP基因在小麦茎中的表达量普遍高于小麦叶，这可能与WDV病毒粒体通过异沙叶蝉进入植物韧皮部组织，韧皮部的运输方向为由植物顶端向根部运输，因此有大量的WDV病毒粒体存在于茎部。
　　(3)首次克隆并测序了异沙叶蝉6个持家基因RPS23e、UBC、Beta-TUB、GAPDH、18SrRNA和ACT2。以这6个持家基因为内参基因，构建了RT-qPCR相对定量体系并利用Genorm、NormFinder和Bestkeeper软件分析这6个内参基因的稳定性，三个软件分析后均指出RPS23e最稳定，ACT2最不稳定，Beta-TUB和UBC是最稳定的组合。Genorm软件计算出用于标准化的最优内参基因数目至少6个。
　　(4)利用构建的体系分析了不同取食时间点（12 h-156 h，每隔12h为一个时间点）WDV-CP基因在异沙叶蝉中表达量的趋势:12 h-48 h递减，48 h-96 h开始增加，96 h达到最高，96 h-120 h递减，120 h-156 h再一次递增。昆虫体内病毒表达量下降可能是存在唾液腺的病毒粒体由介体口器进入植物韧皮部，而后出现上升是由于持久循回性病毒传播的病毒只能局限在植物韧皮部中复制，当叶蝉继续吸食韧皮部，韧皮部中的病毒粒体再次进入介体体内。如此反复，WDV-CP基因的表达量在异沙叶蝉体内为一个动态平衡。
　　综述所述，利用构建的RT-qPCR体系可以成功检测WDV在小麦和异沙叶蝉体内表达量的变化，有助于研究WDV与小麦和介体之间的互作。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 植物病毒的致病机制

1．1．1 抑制植物的抗病反应

1．1．2 干扰激素调控

1．1．3 干扰细胞周期和基因表达

1．2 植物病毒昆虫介体传毒机制

1．2．1 昆虫介体传毒方式

1．2．2 昆虫介体传毒机制

1．3 基因表达的分析方法

1．3．1 Northern杂交

1．3．2 基因表达系列分析

1．3．3 相对表达序列标签

1．3．4 大规模平行标记测序

1．3．5 DNA微阵列

1．3．6 实时荧光定量PCR

1．4 实时荧光定量PCR内参基因的选择

1．4．1 内参基因选择的标准

1．4．2 内参基因选择的方法

1．5 小麦内参候选基因的研究进展

1．6 植物病毒昆虫介体(半翅目)内参候选基因的研究进展

1．7 小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus，WDV)

1．7．1 WDV的生物学特点与研究进展

1．7．2 WDV的传毒介体异沙叶蝉(P strialus L．)

1．8 研究的目的与意义

第二章 小麦体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果与分析

2．2．1 从健康小麦和带毒小麦中提取总RNA电泳图

2．2．2 内参基因和WDV-CP基因扩增效率和特异性检测

2．2．3 检测健康对照小麦和处理组小麦茎和叶的总RNA

2．2．4 检测处理组小麦茎、叶组织的普通RT-PCR产物

2．2．5 五个内参基因CT值的箱线分布图

2．2．6 统计学分析内参基因的CT值差异

2．2．7 分析内参基因的表达稳定性

2．2．8 选择合适的内参基因数目

2．2．9 WDV-CP基因在小麦茎、叶中的相对表达量

2．3 讨论

第三章 异沙叶蝉体内WDV实时荧光定量PCR体系的建立与应用

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果与分析

3．2．1 检测异沙叶蝉带毒率

3．2．2 单头无毒的异沙叶蝉成虫总RNA

3．2．3 内参基因RT-PCR扩增结果

3．2．4 分析异沙叶蝉内参基园核苷酸序列的相似性

3．2．5 14个时间点(0h-156h)单头异沙叶蝉总RNA

3．2．6 内参基因扩增效率和特异性检测

3．2．7 分析内参基因的表达稳定性

3．2．8 选择合适内参基因数目

3．2．9 不同取食时间点WDV-CP基因在异沙叶蝉体内的相对表达量

3．3 讨论

第四章 全文总结与展望

参考文献

附录

致谢

作者简历