PPV和PRV诊断方法的建立及PPV-PRV二联灭活疫苗免疫效力试验

摘要

猪细小病毒病和伪狂犬病都是引起母猪繁殖障碍的主要疾病。猪细小病毒病是由猪细小病毒（PPV）引起的，猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（PRV）引起的。这两种疾病在世界范围内广泛分布，给养猪业造成巨大的经济损失。为了有效预防这两种疾病，本试验建立了检测PPV和PRV的TaqMan荧光定量PCR方法以及检测PPV抗体的ELISA方法，并利用猪细小病毒BQ-C株和猪伪狂犬病毒ΔgE株，试制了PPV-PRV二联灭活疫苗，对试制的疫苗免疫效力进行了初步试验。
　　本研究针对PPV VP2基因和PRV gB基因序列，建立了检测PPV和PRV的TaqMan荧光定量PCR方法。结果表明所建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法敏感性较高，特异性较好，批间、批内变异系数均小于3％，其中针对PPV VP2基因的荧光定量PCR方法可检测到13拷贝的初始模板，针对PRV gB基因的荧光定量PCR方法可检测到167拷贝的初始模板，敏感性是常规PCR方法的100倍。
　　本研究利用杆状病毒载体表达系统表达VP2蛋白（rVP2）作为抗原，建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。经条件优化其最佳抗原包被浓度为10μg/mL，最佳酶标二抗稀释倍数为10000倍，最佳包被液为0.01mol/L碳酸盐缓冲液（PH=9.6），最佳封闭液为5%的脱脂乳-PBS，最佳封闭时间为90 min，最佳血清稀释倍数为200倍，其阳性Cut-off值为0.3。用该方法与商品化ELISA试剂盒分别检测360份临床血清样品，结果表明建立的ELISA方法检测PPV抗体阳性率为75.00%，商业化ELISA试剂盒检测PPV抗体阳性率为75.83%，二者符合率为94.17%。
　　本研究利用本实验室保存的PPV-BQ-C毒株和rPRV-ΔgE毒株制备病毒液作为该二联疫苗的抗原，利用β-丙内酯将病毒液灭活，将上述灭活的两种病毒液以PPV-BQ-C︰rPRV-ΔgE=2︰1的比例混合均匀，以抗原︰佐剂=8.5︰1.5的比例乳化制成疫苗。对疫苗进行初步检验后免疫后备母猪，二联疫苗于免疫后四周PPV HI抗体水平达到高峰，PPV-PRV二联灭活疫苗组HI抗体水平为1﹕776，PPV商业灭活疫苗组HI抗体水平为1︰445，免疫后PPV-PRV二联灭活疫苗组PRV中和抗体水平最高为1︰59.46，PRV商业苗组PRV中和抗体水平最高为1︰32.70。为了研究PPV-PRV二联灭活疫苗的免疫保护效力，对免疫后的后备母猪分别用PPV和PRV强毒攻击，通过检测母猪各组织中的病毒载量来评价疫苗的保护作用。结果显示攻毒后4周，攻PPV强毒后PPV-PRV二联苗组各组织中均检测不到病毒；攻PRV强毒的各组中，PPV-PRV二联苗组在肝脏中能检测到病毒，表明该二联灭活疫苗可抵抗PPV强毒攻击，但不能完全抵抗PRV强毒攻击。

目录

封面

声明

硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略表

第一章 引 言

1.1猪细小病毒病及其疫苗研究进展

1.2 猪伪狂犬病及其疫苗研究进展

1.3 研究的目的与意义

第二章 TaqMan荧光定量PCR方法的建立

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 检测PPV 抗体rVP2-ELISA方法的建立

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 PPV–PRV二联灭活疫苗免疫效力试验

4.1 材料

4.2 方法

4.3 统计分析

4.4 结果

4.5 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历