哺乳动物源呼肠孤病毒激活PI3K/Akt通路调控宿主抗病毒免疫应答的分子机制

摘要

哺乳动物源呼肠孤病毒（Mammalian Reovirus，MRV）是一类在自然界广泛存在病原体，能够感人及几乎所有的哺乳动物。人感染MRV症状比较温和，一般不引起明显的临床症状。但随着对MRV研究的深入，人们发现MRV感染与人类疾病脑膜炎、新生儿肝炎及胆道闭锁等疾病相关性密切。近年来，在世界范围内新分离到多种野生型MRV，尤其是野生动物源分离株，具有重组病毒的特点。结合野生动物源病毒亨德拉病毒、尼帕病毒、埃博拉病毒、寨卡病毒、SARS及MERS等，跨种间传播造成人类及其他动物严重疾病的情况，MRV对人和动物的健康的构成的潜在威胁越发引起人们的关注。
　　病毒在感染过程中通过调节宿主细胞内的信号通路影响宿主细胞内的生理活动，如PI3K/Akt信号通路。宿主方面也会通过多种机制限制病毒的复制，维持细胞的稳态。其中天然免疫系统是宿主抵御病原微生物感染的重要防线，能够在病原微生物感染期间识别病原体相关分子模式，通过天然免疫系统中关键的接头蛋白分子MAVS和STING，诱发宿主的免疫应答，限制和清除病原微生物的感染。事实上，多数病毒的感染过程中，宿主细胞通过多种途径活化机体抗病毒状态。干扰素刺激基因途径是宿主影响病毒增殖宿主抗病毒机制重要形式，能够通过多种途径抑制病毒的增殖，不仅能够直接作用于病毒病原，在病毒生活周期的早期或晚期抑制病毒感染，还能够增强宿主天然免疫模式识别受体识别病原相关分子模式的能力，激活宿主的天然免疫系统。MRV的基因组dsRNA是激活宿主的天然免疫应答反应强刺激剂，能够激活宿主I型干扰素通路，但MRV感染过程中活化宿主的抗病毒免疫反应的分子机制还不清楚。
　　本研究以两株不同血清型野生动物源MRV，3型毒株MPC/04和1型MRV毒株B/03感染A549细胞为模型，通过双荧光素酶报告基因系统、荧光定量RT-PCR和RNA干扰等试验技术，分析 MRV感染过程中ISGs的表达变化趋势及ISGs蛋白对 MRV复制的影响能力。结果表明MPC/04和B/03在感染A549细胞时，均能够激活宿主细胞的ISRE元件，促进IFITM1、ISG15和Viperin等ISGs的表达。过表达Viperin及ISG15蛋白能够明显的抑制MPC/04和B/03的复制，而IFITM1蛋白对MPC/04和B/03的复制影响不明显。根据本实验室猫源I型干扰素通路报告基因的平台，构建猫源MAVS和STING分子，MAVS和STING均能够通过激活转录因子NF-κB和IRF3通路激活IFN-β通路，并通过JAK/STAT1激活ISRE启动子元件，促进Viperin和ISG15表达。过表达人源MAVS和STING分子均能够明显的抑制MPC/04和B/03的复制，但下调A549细胞内MAVS和STING蛋白表达不能够减弱MPC/04和B/03对ISRE启动子的激活。此外，MPC/04和B/03感染不表达IFN-β基因的Vero细胞系同样能够激活其ISRE启动子。封闭A549细胞I型IFN及II型IFN受体，不影响MPC/04和B/03激活ISRE途径的能力。说明MRV感染激活ISRE启动子元件不依赖于经典的IFN/JAK/STAT1途径。
　　为进一步探索MRV活化ISGs表达是否依赖于PI3K/Akt信号通路的分子机制，通过Western blot和RNA干扰等方法，分析MRV感染过程对PI3K/Akt通路的激活情况。MPC/04和B/03在感染早期能够激活A549、HEK293T和Vero细胞内Akt的磷酸化。PI3K特异性抑制剂LY294002和Wortmannin处理，及下调p85α亚基蛋白表达均能够抑制MPC/04诱导Akt的磷酸化。此外，Chlorpromazine抑制Clathrin内吞途径显著降低 MPC/04和B/03诱导的Akt磷酸化程度，而Genistein抑制Caveolin内吞途径不影响MPC/04和B/03诱导的Akt磷酸化程度。siRNA干扰A549 细胞Clathrin表达显著影响MRV诱导的Akt磷酸化程度。MPC/04感染早期同样能够诱导FAK激酶的磷酸化，不能够引起Gab1的磷酸化。FAK激酶特异性抑制剂PP2处理能够阻断MRV感染诱导的FAK和Akt的活化，干扰FAK蛋白的表达及过表达FAK显性负性突变体均能够明显抑制MRV激活PI3K/Akt信号通路。表明MRV感染早期通过病毒Clathrin介导的内吞途径及FAK磷酸化，激活宿主PI3K/Akt信号通路。MPC/04和B/03感染早期能够诱导Akt依赖的EMSY磷酸化，过表达EMSY能够促进MPC/04和B/03的复制。PI3K抑制剂LY294002处理、干扰Akt表达及上调EMSY的表达均能够抑制MPC/04和B/03感染激活ISRE启动子元件，及上调IFITM1，Viperin和ISG15的表达。表明MRV通过PI3K/Akt信号通路磷酸化EMSY促进ISGs的表达。
　　总之，MRV在感染过程中能够激活宿主的抗病毒反应，促进ISGs的表达。MRV激活ISRE启动子元件不依赖于经典的IFN/JAK/STAT1通路，而是通过Clathrin介导病毒内吞途径激活FAK活化PI3K/Akt信号通路，并进一步磷酸化下游分子EMSY调控ISGs的表达，抑制病毒的增殖。这些结果不仅为研究病毒激活宿主抗病毒免疫反应提供新的角度，还为进一步研究MRV致病分子机制和MRV抗肿瘤制剂的应用开发等提供理论依据。

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第一章引言

1.1 MRV概述

1.2 MRV感染与宿主反应

1.2 天然免疫与病毒感染

1.3 病毒感染与PI3K/Akt信号通路

1.4本研究的目的和意义

第二章 MRV诱导干扰素刺激基因表达及其抗病毒作用研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 经典I型干扰素通路在MRV活化ISGs表达中的作用

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 MRV激活PI3K/Akt/EMSY通路调控抗病毒免疫反应的分子机制

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

个人简历