哈克尼西棉细胞质雄性不育三系材料microRNA及转录组联合分析

摘要

在棉花杂交种生产过程中，细胞质雄性不育材料为基础的三系配套育种已被广泛应用于杂交种的生产，极大的降低了人工去雄制种的生产成本，更有利于杂交棉品种的推广应用。在开花植物中，细胞质雄性不育系不育性状(CMS)具有母系遗传特征，不能够产生有功能的花粉，败育明显。细胞质雄性不育可由细胞核基因组与线粒体基因组不匹配所致，且雄性育性能够被核恢复基因(Rf)恢复。CMS/Rf的配套系统对于商业化生产杂交种十分有利，但目前为止，棉花细胞质雄性不育发生及育性恢复的分子机制仍有待进一步研究。本实验以哈克尼西棉细胞质雄性不育系(A)，保持系(B)及恢复系(R)3mm小花蕾为材料，采用高通量测序技术来鉴定已知miRNAs及预测新miRNAs，并结合转录组数据对细胞质雄性不育发生及育性恢复相关miRNAs进行靶基因预测及富集分析，探讨棉花细胞质雄性不育发生及育性恢复背后的分子机制，为进一步利用杂种优势及商业化育种奠定基础。实验结果主要为:
　　1.鉴定了62个保守的miRNAs家族共计370个已知的miRNAs，新预测27个miRNAs。其中，A-B和A-R两个比较组合中分别鉴定了72和126个差异表达miRNAs。对已知和新预测的miRNA进行靶基因预测，共预测了4686个靶基因，其中包括转录因子家族基因和功能基因，如SPL，MYBs，NAC，转录因子和PPR及蛋白激酶家族基因等。
　　2.根据miRNA-target存在负调控关系，结合小RNA测序及转录组数据，在A-B和A-R两个比较组合中分别构建了15和47个miRNA-target调控组合，并荧光定量进行了验证。
　　3.依据A-B和A-R两个比较组合中差异表达miRNA-target调控组合，构建了与细胞质雄性不育发生或育性恢复有关的miRNA调控网络。如hbr-miR156-SPL10组合可能参与调控细胞质雄性不育发生，gra-miR7505b-PPR组合可能参与调控育性恢复。
　　4.分析了差异表达的PPR基因结构，预测了特异位点氨基酸和结合的特异核苷酸序列。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 棉花细胞质雄性不育及育性恢复的研究

1．1．1 棉花恢复基因及不育基因的研究

1．1．2 三系材料间差异基因的研究

1．1．3 花粉发育相关的物质

1．2 棉花中miRNA研究进展

1．2．2 棉花中miRNAs的鉴定

1．3 植物花药发育过程中miRNA的研究

1．3．1 miR156／7

1．3．2 miR159

1．3．3 miR167

1．3．4 miR172

1．3．5 miR319

1．3．6 miR396

1．4 研究目标及内容

2．1．1 试验材料

2．1．2 实验试剂和主要仪器

2．1．3 总RNA的提取

2．1．4 小RNA的提取

2．2 试验方法

2．2．1 小RNA及转录组文库构建及测序

2．2．2 已知和新miRNA的鉴定

2．2．3 三系材料间miRNA和转录本差异表达分析

2．2．4 靶基因预测及功能注释

2．2．5 差异miRNAs和差异靶基因的实时荧光定量验证

2．2．6 PPR蛋白结构分析

3．1 总RNA质量鉴定

3．2 转录组及小RNA测序数据分析

3．3 已知miRNAs的鉴定

3．4 新的miRNAs预测

3．5 三系材料间差异表达miRNAs分析

3．6 已知和新miRNAs的靶基因预测及注释

3．7 RT-qPCR验证miRNA-target pair的调控模式

3．8 PPR家族基因结构分析

第四章 讨论

4．1 测序数据分析

4．2 调控网络构建

4．2．1 细胞质雄性不育调控网络

4．2．2 育性恢复调控网络

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简历