不同感染状态结核病牛免疫应答差异分析及分子标识筛选

摘要

不同感染状态的结核病牛对牛群健康的影响不同，结核潜伏感染患牛(LTBI)通常是指患牛体内存在牛分枝杆菌，结核菌素皮内变态反应呈阳性，但无临床症状，也不排菌。在某些情况下，患牛可以一生持续感染而不发病。而活动性结核患牛，又称开放性结核患牛，是指具有明显临诊症状的结核菌素阳性牛，这种病牛可从鼻分泌物、乳汁和粪便不断排出病原菌，因而对周围的健康牛群和人类造成具大威胁，应立即扑杀。目前，牛结核病主要的临床检测方法有结核菌素皮内变态反应、IFN-γ释放试验和血清学检测等。但这些方法无法确定结核病牛所处的感染状态，为了弥补这一缺陷，本研究拟通过对不同感染状态的结核病牛进行基因表达谱芯片分析，从而筛选出差异基因，并进行验证，以探究其作为检测不同感染状态结核病牛的分子标识的潜力。具体开展了以下研究工作:
　　为了对不同感染状态的结核病牛进行基因表达谱芯片分析，本研究通过结核菌素皮内变态反应、IFN-γ释放试验和鼻拭子巢式PCR检测，筛选了3个牛场共368头奶牛，最终选定了5头牛为开放性结核患牛，6头牛为潜伏感染结核患牛，5头健康牛。将以上牛分别设置为开放性结核组、潜伏感染结核组和健康组，采集外周抗凝血，分离外周血淋巴细胞，采用PPD-B进行刺激，6-8 h后收取细胞，提取细胞RNA，采用Bovine（牛）Affymetrix3IVT基因表达芯片进行表达谱检测。
　　通过对各组表达谱差异分析，筛选出7个可能有作为分子标识的差异基因，基因标志分别为:BOLA、LOC508666、BOLA-DQB、DDX3Y、UTY、LOC781494、LOC786808。根据其基因序列设计实时荧光定量PCR引物，并对6个样品进行验证，同时通过结核菌素皮内变态反应、IFN-γ释放试验和鼻拭子巢式PCR检测对其所处的感染状态进行验证。结果显示有C-Cmotif chemokine23、majorhistocompatibility complex, classⅡ, DQ beta和non-classical MHC classⅠ antigen这3个基因在开放性结核病牛和潜伏感染牛之间的表达量有显著的差异。
　　综上所述，本研究成功地筛选出了3组不同感染状态的结核病牛;并通过分离其外周血淋巴细胞进行刺激后通过表达谱芯片分析差异基因;根据表达谱芯片检测的结果挑选出7个差异及应进行验证;结果显示3个基因在开放性结核牛、潜伏感染结核牛之间差异显著，推测其具有作为新的检测不同感染状态结核病牛的分子标识的潜力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 牛结核病的研究概况与现状

1．1．1 牛结核病的危害

1．1．2 牛结核病的流行情况

1．2 牛结核病的不同感染状态

1．2．1 健康牛

1．2．2 潜伏感染牛

1．2．3 活动性结核病牛

1．3 牛结核病主要诊断技术研究进展

1．3．1 临床诊断方法

1．3．2 细菌学检测

1．3．3 免疫学检测方法

1．3．4 分子生物学检测方法

1．4 牛结核病诊断的分子标识研究进展

1．4．1 用于牛结核病血清学诊断的分子标识

1．4．2 用于细胞免疫诊断的分子标识

1．5 本实验研究的目的意义

第二章 开放性结核病牛、潜伏感染牛及健康牛的筛选

2．1 材料

2．1．1 主要试剂

2．1．2 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 结核菌素皮内变态反应

2．2．2 IFN-γ释放试验(IGRA)

2．2．3 鼻拭子巢式PCR检测

2．2．4 不同感染状态结核病牛的判定标准

2．3 结果与分析

2．3．1 结核菌素皮内变态反应

2．3．4 检测结果的判定及分析

2．4 讨论

第三章 牛基因表达谱芯片杂交筛选牛结核病不同感染时期的分子标识

3．1 材料

3．1．1 主要试剂

3．1．3 主要溶液的配制

3．2 方法

3．2．1 牛外周血白细胞的分离

3．2．2 牛外周血白细胞的培养及刺激

3．2．4 牛外周血白细胞RNA质量的验证

3．2．5 表达谱芯片分析

3．3 结果与分析

3．3．1 牛外周血白细胞的分离

3．3．2 牛外周血白细胞的培养及刺激

3．3．3 牛外周血白细胞的RNA提取

3．3．4 牛外周血白细胞RNA质量的验证

3．3．5 表达谱芯片检测样品的选择

3．3．5 活动性结核病牛、潜伏感染牛和健康牛的PBMCs对PPD-B刺激的表达谱比较

3．3．6 潜在的分子标识基因

3．4 讨论

第四章 牛结核病不同感染时期分子标识的初步验证

4．1 材料

4．1．1 主要试剂

4．2．3 荧光定量PCR引物的设计与合成

4．2．4 实时荧光定量PCR方法的建立

4．2．4 实时荧光定量PCR检测不同感染状态结核病牛相关分子标识的表达

4．3．2 实时荧光定量PCR方法的建立

4．3．3 不同感染状态牛的分子标识基因的检测

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历