基因Ⅶ型新城疫病毒主要毒力蛋白功能研究及应用

摘要

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的毒力由多个基因共同调控，这些基因主要包括F、HN、L和NP基因。本研究首先以基因Ⅶ型NDV F蛋白作为研究对象，对F蛋白的保守序列457-461位氨基酸进行单点突变，获得不同的突变体蛋白。研究发现，突变体F蛋白与野生型F蛋白均可定位在细胞表面。除N460位点以外的其余4个F蛋白突变体在同型HN蛋白的协同作用下，可以显著地增强细胞融合能力，表现为合胞体数量的增多和融合面积的扩大;此外，单独转染F蛋白突变体质粒，发现T458位和G459位氨基酸的突变，可以不依赖于HN蛋白独立诱导膜融合。通过反向遗传操作技术，成功拯救了5株突变病毒，分别是rNDV-V457D、rNDV-T458D、rNDV-G459D、rNDV-N460D和rNDV-L461D，且获救的毒株可稳定传代。NDV F基因突变病毒在DF-1细胞上的增殖速度和最高滴度均低于rNDV，其中，rNDV-T458D、rNDV-L461D与rNDV相比，在感染24h时病毒滴度具有显著差异(p＜005)，在感染40h和48h时，rNDV-T458D和rNDV-G459D与rNDV相比均具有极显著差异(p＜001)，并且rNDV-T458D和rNDV-G459D的病毒毒力由强毒变为中等毒力。此外，上述NDV F基因突变株感染SPF鸡后分别检测病毒在脏器和拭子中的含量，发现各突变株在不同组织样品中的病毒滴度均低于rNDV，rNDV呈现全身性高病毒滴度分布，其中在脾脏和法氏囊中病毒含量最高，小肠中也有较高的病毒滴度;而rNDV-T458D、rNDV-G459D和rNDV-L461D主要存在于免疫器官脾脏和法氏囊中，rNDV-V457D在小肠中病毒含量最高。因此，与rNDV相比，F蛋白的上述5个点突变降低了各突变株病毒在宿主体内的复制能力。
　　L蛋白是NDV中最大的结构蛋白，它除了具有5'端加帽、帽依赖的甲基化转移酶活性及3，端添加多聚腺苷酸尾巴功能以外，还参与病毒基因组的转录和复制，与病毒的毒力紧密相关。对L蛋白的保守结构域K-D-K-E进行突变，成功获救了4株NDVL蛋白突变株，其病毒毒力显著减弱，由强毒株均突变为弱毒株，且突变病毒在DF-1细胞中的增殖能力低于rNDV。同时，将这4株病毒连续传至15代，测序结果证明突变位点依然存在，可以稳定遗传。突变弱毒株免疫SPF鸡21d后用基因Ⅶ型强毒NDV-74株攻毒，均可完全保护，其中rNDV-E1954Q组攻毒后，未检测到病毒排毒。在此突变毒株的基础上，构建了F蛋白突变的重组病毒rNDV-F+E1954Q，该重组病毒的毒力显著低于野生型NDV，免疫SPF鸡21d后攻毒，亦可完全保护。攻毒后检测排毒情况和脏器中病毒含量，发现各脏器中病毒载量及排毒量均低于LaSota免疫组。
　　此外，本研究缺失NP蛋白抗原表位的18个氨基酸和突变F蛋白裂解位点，构建基因Ⅶ型NDV负标记株，获救的病毒具有毒力低、滴度高和免疫原性好等优点。免疫SPF鸡21d后攻毒，可完全保护，且排毒量和脏器病毒载量均低于LaSota对照组。本研究的结果为NDV新型疫苗的研制积累了原始数据，提供了理论支撑。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 副黏病毒及其成员

1．2 副黏病毒介导的膜融合

1．3 新城疫病毒概述

1．4 NDV结构蛋白及其功能

1．4．3 M蛋白

1．4．4 F蛋白

1．4．5 HN蛋白

1．4．6 L蛋白

1．5 新城疫疫苗的研究进展

1．5．2 灭活疫苗

1．5．4 表达细胞因子的新城疫疫苗

1．6 本研究的目的及意义

第二章 基因Ⅶ型NDV F蛋白突变体的构建及其功能分析

2．1 材料和方法

2．1．4 NDV F蛋白突变体重组质粒的构建

2．1．6 细胞融合试验

2．1．10 突变病毒毒力分析

2．2．1 F蛋白及其突变体的细胞融合试验

2．2．2 细胞表面表达分析试验

2．2．3 F蛋白及其突变体的Western-blot分析

2．2．4 获救病毒的鉴定

2．2．5 获救病毒毒力分析

2．2．6 突变病毒的融合试验

2．2．7 获救病毒复制动力学试验

2．2．8 获救病毒的感染性与组织嗜性分析

2．3 讨论

第三章 基因Ⅶ型新城疫病毒L蛋白突变株构建及免疫评价

3．1 材料和方法

3．1．4 NDV L蛋白氨基酸突变位点的选择

3．1．5 突变病毒拯救

3．1．8 突变病毒的遗传稳定性试验

3．1．14 NDV突变株免疫商品化鸡及其攻毒保护试验

3．2 试验结果

3．2．1 突变病毒的复制动力学曲线

3．2．2 突变病毒毒力分析

3．2．3 突变病毒遗传稳定性分析

3．2．4 获救弱毒株免疫保护试验

3．2．6 rNDV-F+E1954Q病毒的传代及毒力分析

3．2．8 rNDV-F+E1954Q免疫及攻毒试验

3．3 讨论

第四章 基因Ⅶ型新城疫病毒标记株的构建及其免疫评价

4．1 材料和方法

4．1．3 重组质粒的构建

4．1．4 重组病毒的拯救

4．1．8 动物回归实验

4．2．2 rNDV-NPΔ+F株遗传稳定性分析

4．2．3 rNDV-NPΔ+F株在鸡胚中的生长特性及病毒毒力结果

4．2．4 rNDV-NPΔ+F株的病毒复制动力学曲线试验

4．2．5 间接免疫荧光试验结果

4．2．6 动物回归试验结果

4．2．8 rNDV-NPΔ+F标记株免疫攻毒后排毒情况分析

4．2．9 rNDV-NPΔ+F标记株免疫后抗体持续期检测

4．3 讨论

第五章 全文结论

参考文献

附录

致谢

作者简历