牛间充质干细胞成肌/成脂分化中差异miRNAs的鉴定及miR-23a调控机制研究

摘要

肌内脂肪是衡量牛肉质量的重要标准之一，与牛肉的多汁性、嫩度以及风味有很大关系。骨骼肌和肌内脂肪组织是由中胚层的间充质干细胞分化而来的。牛的骨骼肌的发生起始于妊娠早期，脂肪发生起始于妊娠中期。在胚胎及胎儿期，在转录因子和miRNAs等调控分子的调控下，间充质干细胞向骨骼肌、骨骼、脂肪、成纤维、血管等细胞分化。充质干细胞向骨骼肌和脂肪两个方向的分化，对牛后天生产性能具有重要影响。为了探索miRNAs调控间充质干细胞向骨骼肌和脂肪分化过程中的机理，本研究以牛5月龄胎儿骨骼肌来源间充质干细胞为研究对象，建立了体外成肌分化和成脂分化模型，通过miRNA测序和生物信息学分析，筛选了骨骼肌和脂肪分化前后差异表达miRNAs，分析验证了差异表达miRNAs中miR-23a在成脂分化过程中的功能和机理。得到如下主要结果:
　　1.在采用Ⅳ型胶原酶消化方法过程中，采用CD140a为表面标记进行成肌细胞和前体脂肪细胞的分离纯化，对牛胎儿骨骼肌来源成肌细胞和前体脂肪细胞分离方法进行优化。在成肌细胞分离纯化方面，CD140a阴性细胞诱导后形成了大量的肌管，而CD140a阳性组肌管则很少、很短;免疫荧光鉴定显示CD140a阴性细胞MyHC阳性表达，肌管的数量多、形态清晰，而CD140a阳性细胞肌管数量相对很少、形态不完整;定量PCR反应结果表明，CD140a阴性细胞中MYOD、MYOG和MYF5三个基因表达水平要显著高于CD140a阳性细胞。在前体脂肪细胞分离纯化方面，CD140a阳性细胞出现了大量的脂肪滴，阳性细胞分化成脂肪细胞的比例显著高于阴性细胞;定量PCR反应结果表明，CD140a阳性细胞中ZNF423、PPARγ、C/EBPα和FABP4四个基因表达水平要显著高于CD140a阴性细胞。本研究建立了一种分离牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞和成肌细胞的优化方法，为开展牛体外骨骼肌和脂肪诱导分化研究提供了一种有效的技术手段。
　　2.在前期采用地塞米松、IBMX、胰岛素和罗格列酮联合进行诱导的基础上，本研究增加了BMP4对牛前体脂肪细胞进行成脂诱导，诱导后细胞质中脂滴数量明显增多，脂滴也更大，定量PCR反应结果表明，BMP4实验组中ZNF423、PPARγ、C/EBPα和FABP4四个基因表达水平均高于对照组。实验结果表明，BMP4能够促进牛前体脂肪细胞体外成脂诱导。
　　3.通过miRNA测序和生物信息学分析，筛选出了骨骼肌和脂肪分化过程中差异表达miRNA，其中:以牛胎儿骨骼肌来源成肌细胞的成肌分化为研究对象，筛选出了成肌分化过程中的90个差异表达miRNAs，其中上调的45个，下调的45个;以牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞分化为对象，筛选出了成脂分化过程中的56个差异表达miRNAs，其中上调的30个，下调的26个。
　　4.在牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞成脂分化中，本研究筛选出的miR-23a在诱导1d后表达量显著降低并保持整个分化过程;转染miR-23a模拟物会抑制脂肪分化，细胞中脂滴减少，PPARγ和C/EBPα的mRNA表达水平显著降低;转染miR-23a抑制物会促进脂肪分化，细胞中脂滴增多，PPARγ、C/EBPα和FABP4的mRNA表达水平显著升高。通过Targetscan预测，miR-23a在ZNF423基因上有可能的靶位点。通过双荧光素酶报告系统，证实了miR-23a与牛ZNF423的3'UTR可以互作。转染模拟物后ZNF423蛋白表达水平显著降低，而转染抑制物后ZNF423蛋白表达水平显著升高。结果证实，miR-23a以ZNF423为靶基因，抑制牛胎儿骨骼肌来源的前体脂肪细胞分化过程。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 miRNA及其在骨骼肌和脂肪形成中的作用

1．1．1 miRNA概述

1．1．2 miRNA在骨骼肌和脂肪分化中的作用

1．2 骨骼肌分化的调控

1．2．1 骨骼肌的组成与结构

1．2．2 肌纤维的类型与特点

1．2．3 骨骼肌的分化与调控

1．3 脂肪细胞分化的调控

1．3．1 脂肪的种类与组成

1．3．2 脂肪的分化与调控

1．4 肉牛肌内脂肪

第二章 牛胎儿骨骼肌来源成肌细胞和前体脂肪细胞的分离与诱导

2．1 材料和方法

2．1．1 试验动物

2．1．2 主要仪器设备

2．1．3 主要试剂及配制方法

2．1．4 细胞分离

2．1．5 细胞培养

2．1．6 成肌细胞的成肌诱导分化

2．1．7 前体脂肪细胞的成脂诱导分化

2．1．8 采用BMP4开展前体脂肪细胞的成脂诱导

2．1．9 油红O染色

2．1．10 免疫荧光染色

2．1．11 总RNA提取

2．1．12 反转录

2．1．13 定量PCR反应

2．1．14 qPCR数据统计

2．2 结果

2．2．1 间充质干细胞的分离和培养

2．2．2 CD140a阳性／阴性细胞的成肌诱导分化和免疫荧光鉴定

2．2．3 CD140a阳性／阴性细胞的成脂诱导分化和油红O染色

2．2．4 CD140a阳性／阴性细胞分选对成肌相关基因的表达的影响

2．2．5 CD140a阳性／阴性细胞分选对成脂相关基因的表达的影响

2．2．6 利用BMP4诱导前体魔肪细胞的油红O染色鉴定结果

2．2．7 利用BMP4诱导前体脂肪细胞对成脂相关基因的表达的影响

2．3 讨论

2．3．2 利用CD140a分选纯化牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞

2．3．3 利用BMP4诱导前体脂肪细胞

第三章 成肌细胞分化中差异miRNAs的鉴定

3．1 材料和方法

3．1．2 主要试剂及配制方法

3．1．3 文库构建

3．1．6 差异表达miRNAs筛选

3．1．7 靶基因预测

3．2．1 测序数据质量控制

3．2．2 sRNA长度筛选

3．2．3 成肌分化差异miRNA筛选

3．2．4 靶基因预测结果

3．2．5 成肌分化靶基因的GO分析和KEGG通路分析

3．3 讨论

第四章 前体脂肪细胞分化中差异miRNAs的鉴定

4．1 材料和方法

4．1．3 miRNA stem-loop qPCR验证

4．2 结果

4．2．1 测序数据质量控制

4．2．2 sRNA长度筛选

4．2．3 成脂分化差异miRNAs筛选

4．2．4 靶基因预测结果

4．2．5 成膳分化靶基因的GO分析和KEGG通路分析

4．2．6 差异表达miRNA的qPCR验证

4．3 讨论

第五章 成脂分化中miR-23a的调控机制研究

5．1 材料和方法

5．1．1 主要仪器设备

5．1．2 主要试剂及配制方法

5．1．3 反转录

5．1．4 定量PCR反应

5．1．5 油红0染色

5．1．6 Western blot

5．1．7 靶基因预测

5．1．8 双荧光素酶报告载体构建

5．1．9 细胞转染

5．2 结果

5．2．1 转染miR-23a模拟物对牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞分化的影响

5．2．2 敲低内源miR-23a对牛胎儿骨骼肌来源前体脂肪细胞分化的影响

5．2．3 bta-miR-23a的靶基因预测及其调控机制研究

5．3 讨论

6．1 研究结论

6．2 研究创新点

6．3 下一步研究建议

参考文献

致谢

作者简历