口蹄疫病毒VP3定点突变体的构建及其生物学特性和免疫血清学研究

摘要

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种重大动物疫病，我国历史上发生和近年来流行的有O、A和Asia1三个血清型，其中O型口蹄疫对我国畜牧养殖业的威胁最大。疫苗免疫是防控本病的重要手段，现有的市售口蹄疫疫苗包括常规灭活疫苗和合成肽疫苗。但是，前者不利于与口蹄疫病毒自然感染动物的鉴别诊断，后者在有新发外来病毒株入侵时可能会出现免疫失败。目前，随着口蹄疫反向疫苗学的发展，借助基因工程手段缺失或沉默口蹄疫病毒非结构蛋白的免疫优势表位创制的负标记疫苗有效解决了第一个瓶颈问题;本研究探索性地在口蹄疫病毒外部衣壳蛋白VP3的G-H环中进行靶向改造，旨在为广谱、多联（价）、正标记疫苗的研发提供借鉴性思路。
　　首先，为了评估外部衣壳蛋白VP3G-H环展示外源标签的能力，本研究利用成熟的O型Cathay拓扑型口蹄疫病毒反向遗传操作技术平台(pOFS→rHN)，构建了两种HA插入型（第3171-3172位）的基因组全长cDNA。遗憾的是，未能拯救到基因工程毒。遂将HA、Flag、VSV-G替换性引入该区段，构建了六种外源标签替换型的基因组全长cDNA。同样地，也未能获得基因工程毒，而且，其中一种HA替换型的口蹄疫病毒基因组全长cDNA经密码子优化后仍无法获得基因工程毒。这表明骨架病毒rHN的VP3G-H环中存在着与口蹄疫病毒感染性相关的关键性氨基酸。
　　为此，本研究对照一种HA修饰型质粒，对骨架病毒的基因组全长感染性cDNA进行定点突变，构建了四种突变型质粒，同时，参考C型和SAT2型口蹄疫病毒代表株，构建了三种血清型间嵌合型质粒。转染结果证实，仅有突变型质粒pOFSv3174Y和血清型间嵌合型质粒pOFSD3173N+V3174E+N3179C具有感染性，两种定点突变体分别命名为rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C。
　　最后，本研究对两种定点突变体与骨架病毒进行了生物学特性鉴定和免疫血清学比较分析。试验发现，①rHND3173N+V3174E+N3179C定点突变体在BHK-21细胞上连续传代时容易引发假回复突变和第二位点突变;②rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C细胞传代毒均获得了侵染CHO系列细胞的能力（非RGD依赖型受体），③rHN、rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遗传稳定株在BHK-21细胞上的蚀斑表型、复制动力学略有差异，但差异不显著。④与rHN相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遗传稳定株的体内/外致病力均有下降，后者更为明显;⑤与rHN的免疫阳性血清相比，rHNV3174Y和rHND3173N+V3174E+N3179C遗传稳定株的免疫阳性血清对我国现已分离的O型Mya98和PanAsia-1谱系FMDV的交叉中和能力均有不同程度的改变，且后者的r值均大于05(符合OIE规定标准，r≥0.3)。
　　上述研究结果提示，可通过尝试性地在空间结构上外露于病毒衣壳表面且靠近口蹄疫病毒抗原位点的茎环区进行氨基酸残基的人为修饰，有望针对性地拓实口蹄疫疫苗候选株的免疫效力。

目录

声明

摘要

英文缩略表

第一章 引言

1．1 口蹄疫

1．2 口蹄疫病毒

1．2．1 口蹄疫病毒基因组

1．2．2 口蹄疫病毒粒子结构

1．2．3 口蹄疫病毒的抗原表位

1．2．4 口蹄疫病毒的入侵

1．3 口蹄疫疫苗

1．3．1 口蹄疫病毒灭活疫苗

1．3．2 合成肽疫苗

1．4 研究内容

第二章 口蹄疫病毒VP3定点突变体的构建

2．1 材料

2．1．1 质粒和细胞

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 引物合成

2．2．2 FMDV VP3基因的改造

2．2．3 FMDV基因组修饰型全长cDNA分子克隆的构建

2．2．5 基因工程毒的拯救

2．2．6 基因工程毒的鉴定

2．3 结果

2．3．1 FMDV基因组修饰型全长cDNA质粒的鉴定结果

2．3．2 细胞转染与传代结果

2．3．3 基因工程毒的鉴定结果

2．4 讨论

第三章 口蹄疫病毒VP3定点突变体的生物学特性鉴定

3．1 材料

3．1．1 细胞、病毒和实(试)验动物

3．1．2 引物

3．2．1 基因工程毒Pl基因的扩增与测序

3．2．2 蚀斑形成试验

3．2．3 一步生长曲线的绘制

3．2．4 基因工程毒的致病力试验

3．3 结果

3．3．2 FMDV VP3定点突变体的蚀斑表型鉴定结果

3．3．3 FMDV VP3定点突变体的复制动力学结果

3．3．4 FMDV VP3定点突变体的致病力试验结果

第四章 口蹄疫病毒VP3定点突变体的免疫血清学比较分析

4．1 材料

4．1．3 免疫阳性血清

4．1．4 实(试)验动物

4．1．5 主要试剂和耗材

4．1．6 仪器

4．2 方法

4．2．1 FMDV抗原的制备及安全性检验

4．2．2 FMDV灭活疫苗的配制

4．2．3 动物免疫试验

4．2．5 病毒中和实验

4．3 结果

4．3．1 O型FMDV液相阻断ELISA抗体检测结果

4．3．2 病毒中和实验结果

4．4 讨论

第五章 全文结论

参考文献

致谢

作者简历