芽孢杆菌表面展示系统的构建及其在环境污染生物修复中的应用

摘要

微生物表面展示是将蛋白质表达于细胞表面的方法，可应用于工业、农业和环境修复等领域。作为环境友好、安全的革兰氏阳性模式细菌，枯草芽孢杆菌目前已鉴定出一些锚定蛋白，可将外源蛋白展示表达于孢子的表面，但是菌体表面展示的锚定蛋白发现的很少。因此，开发优化高效的芽孢杆菌的菌体表面展示系统具有重要意义。 在本项研究中，提出了一种基于生物信息学的系统筛选方案，来筛选枯草芽孢杆菌基因组上编码的潜在锚定蛋白，共得到了47个含有自身启动子的候选锚定蛋白。通过构建EGFP荧光报告系统，来评估所选锚定蛋白在其自身启动子作用下的细胞表面展示效率。结果发现，锚定蛋白SpoⅢJ在芽孢杆菌的细胞表面上的展示效果最好。为了确定融合蛋白的表达位置，首先通过比较培养在生孢培养基和营养丰富培养基的细胞荧光值，初步确定其在菌体上表达，再利用超分辨率共聚焦显微镜A1/SIM/STORM进行荧光定位，进一步确定了融合蛋白在菌体细胞表面表达。在锚定蛋白SpoⅢJ和EGFP之间添加连接肽，其中通过添加6个脯氨酸作为连接肽，融合蛋白可以相对增加58.3％的荧光表达量。另外还优化了表达载体，发现该展示系统也可以展示表达外源蛋白质到地衣芽孢杆菌，且表现出较高的效率。 随后在枯草和地衣芽孢杆菌两个系统中表面展示有机磷水解酶OphC2，结果显示，融合蛋白正常表达，且在地衣芽孢杆菌中的有机磷降解酶活性比枯草芽孢杆菌高2.1倍。当在枯草芽孢杆菌中表面展示金属结合蛋白CadR时，其吸附Cd2+的量几乎是原始菌株的7倍。当在枯草芽孢杆菌中表达过氧化氢酶Cat9时，其在菌体中有较高活性，SDS-PAGE结果进一步显示融合的目的蛋白条带在菌体中显示明显多于上清中，与荧光定位实验结果一致。 本研究表明，构建的细胞表面展示系统可在芽孢杆菌细胞表面展示靶蛋白，为利用芽孢杆菌进行生物修复提供了材料。构建的基因工程菌株，有望应用于农药降解、生物催化、生物修复和生物传感等方面。