真核生物源虾青素合成酶在烟草生物反应器构建中的应用研究

摘要

虾青素是一种酮类类胡萝卜素，具有比维生素E和辅酶Q10更强的抗氧化活性，并对癌症、心血管疾病、糖尿病等许多疾病具有药理作用。天然虾青素在食品、保健品及化妆品行业中的广泛应用，使得天然虾青素具有广阔的市场前景。但现有原料的虾青素生产存在效率低、成本高等客观困难，因此目前的虾青素生产无法满足快速增长的市场需求。利用烟草开发高效的虾青素生物反应器是克服这一困难的关键技术。然而，虾青素的烟草生物反应器的前期研究主要采用改造的微生物源虾青素合成酶进行烟草生物反应器构建，对真核生物源虾青素合成酶的利用研究还非常有限。为揭示不同真核生物源虾青素合成酶在烟草中的异源表达生物活性特征，明确开发虾青素烟草生物反应器的关键分子基础，本研究对夏侧金盏花(Adonis aestivalis)、雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）及红发夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)3种真核生物源虾青素合成酶基因进行了密码子优化合成及表达载体构建，通过农杆菌介导的瞬时表达和稳定表达试验分析了其在烟草中合成虾青素的活性差异，并获得了稳定合成虾青素的转基因烟草植株。主要研究结果如下: 1、瞬时表达试验仅能体现出来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶烟草中的生物活性高于来源于雨生红球藻和红发夫酵母的虾青素合成酶，但通过稳定表达试验结合分子修饰可以比较出3种真核生物源虾青素合成酶在烟草中的活性差异。因此，在不同生物源虾青素合成酶在烟草中的生物活性检测中，稳定表达实验比瞬时表达试验更灵敏，更准确。 2、借助亚细胞定位试验和稳定表达试验，根据3种真核生物源虾青素合成酶在烟草叶片细胞内的定位情况，来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶无需分子修饰就可在抗性愈伤组织和再生苗内合成大量虾青素;来源于雨生红球藻的虾青素合成酶经过添加叶绿体靶向肽的分子修饰后仅在抗性愈伤组织内合成微量虾青素;来源于红发夫酵母的虾青素合成酶经过添加叶绿体靶向肽的分子修饰后也无法在烟草内合成虾青素。 3、稳定表达试验及抗性愈伤组织的RT-PCR和UPLC分析表明，来源于夏侧金盏花的虾青素合成酶在烟草内的生物活性最高，来源于雨生红球藻的虾青素合成酶在烟草内的生物活性次之，来源于红发夫酵母的虾青素合成酶在烟草内的生物活性最低。 4、通过对转基因烟株叶片内色素的TLC和UPLC检测分析，表明外源虾青素合成酶可以在烟草内稳定合成虾青素，但其生长发育过程明显慢于正常烟株TN90，净光合速率也明显低于正常烟株TN90。