应激条件下PNPLA3基因对猪肝脏脂代谢的影响

摘要

PNPLA3属于patatin样磷腊酶家族，可参与肝脏脂肪代谢，且该基因的突变与非酒精性脂肪性肝病的发生密切相关。但应激条件下，PNPLA3基因如何影响肝脏脂肪代谢尚不十分清楚。本论文通过三个试验研究应激条件下PNPLA3基因影响猪肝脏脂肪代谢的机理。 试验一 热应激条件下生长猪肝脏PNPLA3的表达及对脂代谢的影响 试验采用单因素随机区组设计，选取27头（来自9窝，3头/窝）体况接近、平均体重为40.8±2.7kg的健康大白阉公猪，随机分为三个处理组:对照组、热应激组和采食量配对组，每个处理9个重复。试验期21d。结果发现:(1)与对照组相比，热应激组肝脏GRP94和p-PERK的表达量显著升高(P＜0.05)，说明热应激可引起肝脏的内质网应激。(2)与对照组和采食量配对组相比，热应激组肝脏中PNPLA3基因表达显著升高(P＜0.05)，而脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、激素敏感脂酶和脂蛋白脂酶的活性均显著降低(P＜0.05)。(3)热应激条件下，肝脏PNPLA3基因的表达与脂肪代谢指标存在相关性。 试验二 永生化猪肝星状细胞制备 采用密度梯度离心法从猪肝脏中分离得到正常的猪肝星状细胞，再以SV40LT过表达慢病毒转染细胞，获得与原代猪肝星状细胞的细胞形态和特性无明显差别的永生化猪肝星状细胞系，为后续试验提供生物学功能稳定、可传代的细胞。 试验三 内质网应激条件下PNPLA3基因的突变对猪肝脏脂肪代谢的影响 构建PNPLA3突变基因慢病毒，并以该病毒感染永生化猪肝星状细胞，72h后再加入5μg/mL衣霉素或DMSO继续培养24h。试验分为六组:(1)空白对照组;(2)空白对照+衣霉素组;(3)感染对照病毒组;(4)感染对照病毒+衣霉素组;(5)感染PNPLA3突变基因病毒组;(6)感染PNPLA3突变基因病毒+衣霉素组。结果发现，(1)在生理条件下和内质网应激条件下，感染PNPLA3突变基因病毒组PNPLA3基因的表达量均显著高于未感染组(P＜0.05)。(2)生理条件下，感染PNPLA3突变基因病毒未影响猪肝星状细胞GRP78和GRP94的蛋白表达;而内质网应激条件下，感染PNPLA3突变基因病毒则可使细胞GRP94的蛋白表达极显著升高(P＜0.01)，但未对GRP78的蛋白表达产生显著影响。(3)生理条件下，感染PNPLA3突变基因病毒可使细胞乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、硬脂酰辅酶A去饱和酶、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和胆固醇调节元件结合蛋白1的基因表达显著升高(P＜0.05);而内质网应激条件下，感染PNPLA3突变基因病毒对上述基因的表达无显著影响。(4)与感染对照病毒组相比，生理条件和内质网应激条件下，感染PNPLA3突变基因病毒均使细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ的蛋白含量显著升高(P＜0.05)。 研究结论: (1)持续热应激会造成猪肝脏发生内质网应激，降低了部分脂肪代谢酶的活性。 (2)热应激会引起猪肝脏PNPLA3基因表达升高，且PNPLA3基因表达与脂肪代谢相关酶活性存在相关。 (3)生理条件下，PNPLA3基因的突变（表达）可影响机体肝脏的脂肪代谢;与正常生理条件相比，内质网应激会抑制PNPLA3基因的突变（表达）对脂肪代谢的影响。