谷子抗拿捕净基因的克隆和转基因玉米的研究以及玉米抗拿捕净体细胞无性系突变体的筛选

摘要

拿捕净(Sethoxydim)是80年代初筛选出的一种高活性的除草剂,它属于环己烯酮类,这类除草剂作用的靶蛋白是乙酰辅酶A羧化酶(ACCase).环己烯酮类除草剂被专门用来防治禾本科杂草,对双子叶作物高度安全,但不能用于禾本科作物.由于这些除草剂具有用量少、活性高、在土壤中易分解等优点,近年来在生产中得到了广泛应用.该研究从高抗拿捕净的谷子品系和普通谷子中克隆出了ACCase基因,并对它们的序列进行了比较,找出了拿捕净作用的靶位点序列.在此基础上,将抗性谷子中克隆的ACCase基因转入玉米自交系中,获得抗拿捕净的转基因植株.同时采用组织培养的方法筛选玉米抗性突变体,获得了有价值的抗性材料,并对其抗性机制进行了探讨.在体细胞无性系突变体的筛选方面,我们直接在培养基中加入一定浓度梯度的拿捕净,通过多轮筛选,最后存活的愈伤组织被认为是抗性愈伤组织.对抗性愈伤组织进行诱导,最终分化成苗.该实验共采用了两个处理:处理一(采用0.5、1、2、5、10 μ M的拿捕净浓度梯度)最终获得了31棵再生植株;处理二(采用5、10、20、50μ M的浓度梯度筛选)仅有综31获得了一个抗性愈伤组织,但无法分化成苗,该愈伤组织在200 μ M的拿捕净浓度下依然能维持旺盛生长.克隆了这个抗性愈伤组织的质体ACCase基因,序列比对发现,它编码的氨基酸并没有发生改变.Southern blotting结果表明,它与对照的杂交信号并没有明显的变化,但杂交条带的大小发生了变化.Northern blotting结果表明,杂交信号比对照增加了2.5倍.根据禾本科作物质体ACCase cDNA序列的保守性,直接采用RACE技术从高抗拿捕净的谷子品系和野生型谷子中克隆出ACCase基因,采用生物信息学的方法证明所克隆的基因编码质体ACCase而非胞质溶胶ACCase.将它们的氨基酸序列与其它物种的真核型ACCase相比较,发现抗拿捕净谷子质体ACCase氨基酸序列的1780处为异亮氨酸,而野生型谷子的为亮氨酸,从而验证了质体ACCase CT功能域的这个单一的氨基酸残基是拿捕净作用的靶位点,它的突变造成了谷子对拿捕净抗性的改变.Southern blotting结果表明,质体ACCase基因在谷子中只有一个拷贝.将克隆的谷子抗拿捕净质体ACCase全长cDNA构建到植物表达载体中.首先对植物表达载体pCAMBIA3301进行了改造,去除了筛选标记基因,将35S启动子换上了在禾本科植物细胞中高效表达的启动子UBI,去除了GUS基因,最后将抗拿捕净谷子质体ACCase全长cDNA构建到其上.采用根癌农杆菌介导法将其转入到玉米的三个优良自交系178、Z3和Z31的幼胚和愈伤组织中.经过共培养、恢复培养、抗性筛选、诱导胚状体以及分化等步骤,最终获得了89棵再生植株.对再生植株进行了PCR和Southern blotting等分子检测,绝大多数再生植株表现为阳性.对部分T1代转基因植株进行了拿捕净抗性检测.结果表明,部分转基因玉米植株表现出对拿捕净的抗性.

目录

文摘

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第一章 绪论

§1楔子

§2体细胞无性系变异及其在作物遗传育种中的应用

§2.1植物体细胞无性系变异的机制

§2.2植物体细胞无性系变异的分类

§2.3体细胞无性系变异在作物改良中的应用

§3植物抗除草剂基因工程研究进展

§3.1抗除草剂基因工程研究的意义

§3.2抗除草剂基因工程的转基因种类

§3.3除草剂转基因作物的国内外研究现状

§3.4转基因抗除草剂作物的风险

§4植物乙酰辅酶A羧化酶的分子生物学与基因工程

§4.1乙酰辅酶A羧化酶催化的反应机制

§4.2乙酰辅酶A羧化酶的定位及分类

§4.3乙酰辅酶A羧化酶的功能

§4.4植物乙酰辅酶A羧化酶的分子生物学

§4.5植物乙酰辅酶A羧化酶对除草剂的敏感性

§4.6植物乙酰辅酶A羧化酶的基因工程

§5研究技术路线

第二章 玉米抗除草剂拿捕净体细胞无性系突变体的研究

§1引言

§2实验材料

§3实验方法

§4结果与分析

§4.1抗拿捕净突变体的获得

§4.2玉米愈伤组织对拿捕净的反应

§4.3玉米抗性愈伤组织质体ACCase基因的cDNA序列分析

§4.4Southern吸印杂交分析

§4.5Northern吸印杂交分析

§5讨论

第三章 谷子质体ACCase基因的克隆与序列分析

§1引言

§2实验材料

§3实验方法

§4结果与分析

§4.1foxACCI 5’端的克隆(5’RACE)

§4.2foxACCI 3’端的克隆(3’RACE)

§4.3 foxACC I全长cDNA的克隆

§4.4谷子质体ACCase的生物信息学分析

§4.5谷子质体ACCase基因的拷贝数分析

§5讨论

第四章 foxACC-R基因转化玉米的研究

§1引言

§2实验材料

§3实验方法

§4结果与分析

§4.1 foxACC-R基因植物表达载体的构建

§4.2根癌农杆菌介导的p3301-ACCase转化玉米

§4.3再生植株的分子检测

§4.3转基因玉米的拿捕净抗性检测

§5讨论

第五章结论

第六章未来研究工作

参考文献

致谢

作者简介

博士期间送交Genbank登录的基因