表达新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒gB基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究

摘要

新城疫、传染性喉气管炎和鸡痘均是鸡的主要呼吸道疾病，给养鸡业造成了巨大的损失。尽管传统方法制备的疫苗在疾病的控制上曾经发挥重要的作用，但随着动物疾病清除计划的进行，需要用更加安全的、能够区分野毒感染的新型疫苗来替代常规疫苗。 禽痘病毒载体疫苗以其特有的优势在疾病的控制中起到了重要的作用，以禽痘病毒为载体已经研制出许多种重组病毒疫苗，其中有的已纪商业化。构建表达多个病原体基因的重组禽痘载体疫苗对于面临多种疾病威胁的养禽业来说尤其具有重要的意义。 本实验利用同源重组将新城疫病毒(NDV)的F和HN基因、传染性喉气管炎病毒(ILTV)的gB基因以及报告基因LacZ插入鸡痘病毒(FPV)的017株的复制非必需区，其中NDV的F、HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ是在早晚期启动子LP2EP2的控制下，大肠杆菌报告基因LacZ在晚期启动子P11的控制下。经过10轮蓝斑纯化获得了包含了NDV的F和HN基因、ILTV的gB基因以及报告基因LacZ的重组鸡痘病毒，称为rFPV-F/HN/gB。经PCR方法证明rFPV-F/HN/gB基因组中含有NDV的F基因、HN基因和ILTVgB基因；间接免疫荧光试验和Western-blot试验表明NDV的F、HN蛋白和ILTVgB蛋白在rFPV-F/HN/gB感染的CEF细胞中获得表达。与亲本毒相比，重组病毒在病毒的复制和致鸡胚成纤维细胞的病变方面无显著不同。 为了检测重组病毒对SPF鸡的保护效果，将60只四周龄的SPF鸡分为四组，第一组翅下刺种1000PFUrFPV-F/HN/gB(20只)、第二组免疫ND弱毒疫苗(LaSota，10只，0.125ml/只)、第二组免疫ILT弱毒疫苗(10只，0.1ml/只)，第四组为非免疫对照鸡(20只)。免疫后4周将重组病毒组和非免疫组随机分为两组，分别为1、5组和4、6组。其中1、2、4组共30只鸡用致死剂量(103EID50)的NDVF48E9株进行肌肉注射，另外的3、5、6组共30只鸡用ILTV王岗强毒(500EID50)经喉内接种。免疫和攻毒后每周采集血清进行抗体检测。并于攻毒后检测排毒、统计发病和死亡率。结果表明：与对照组相比，免疫后3周rFPV-F/HN/gB免疫组能诱发机体产生抗新城疫病毒的ELISA抗体，但抗体水平明显低于LaSota免疫组，NDV攻毒前没有检测到ND的HI抗体，而LaSota免疫组在免疫后2周就显示有HI抗体；同时重组病毒诱发机体产生抗ILTV的ELISA抗体，抗体水平也低于ILT弱毒疫苗免疫组。而非免疫组在攻毒前检测不到任何抗体。LaSota免疫鸡获得完全保护，rFPV-F/HN/gB免疫组的部分鸡(7/10)抵抗ND强毒的攻击，免于死亡，而且死亡鸡发病和死亡时间明显滞后于对照组。NDV的分离检测结果表明：rFPV-F/HN/gB可以有效的控制排毒，但是与LaSota弱毒免疫组相比，不能完全控制病毒的繁殖。ILTV攻击后，rFPV-F/HN/gB和ILT弱毒疫苗免疫鸡对死亡的保护均为10/10，对发病的保护为7/10，非免疫对照组有1/10的死亡率和10/10的发病率；ILTV的分离和PCR检测结果表明rFPV-F/HN/gB具有和ILT商品化弱毒疫苗同样的保护效果。 综合以上实验结果，重组鸡痘病毒rFPV-F/HN/gB能诱导体液免疫，保护机体抵抗强毒的攻击。对新城疫强毒的保护效果略低于弱毒疫苗；对于传染性喉气管炎来说，该重组鸡痘病毒与现用的弱毒疫苗具有同等的免疫效力，但在安全性方面比弱毒疫苗更加优越，不形成潜伏感染，不会散毒，是一个有效的疫苗侯选株。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：插图与附表清单;缩略词表

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第一章 引言

第二章 表达新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒的构建

第三章 表达新城疫病毒F、HN基因和传染性喉气管炎病毒GB基因的重组鸡痘病毒的生物学特性分析

第四章 重组鸡痘病毒对SPF鸡的免疫保护性研究

第五章 结论

第六章 创新点

第七章 文献综述

参考文献

致谢

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