用产酸克雷伯氏菌突变株生产1，3-丙二醇和2，3-丁二醇

摘要

1，3-丙二醇(1，3-PD)和2,3-丁二醇(2，3-BD)均是重要的化工原料，它们在聚酯合成领域有很好的应用前景。在微生物产生1,3-丙二醇的同时，会产生2,3-丁二醇、乳酸、乙醇等副产物。多产物抑制现象(multipleproductsinhibition)是造成1,3-丙二醇产量和甘油转化率低，后提取困难的主要原因，切断对1,3-丙二醇产生不利的副产物的产生途径有望提高1,3-丙二醇产量和甘油转化率，并简化后提取工艺。 本文研究了通气量对KlebsiellaoxytocaM5al产生1,3-丙二醇的影响，确定了通0.4vvm的空气是其产生1,3-丙二醇的最适通气量。通过分析各副产物对1，3-丙二醇生成带来的影响，提出了提高1,3-丙二醇发酵效率的方法—减少乳酸和乙醇的产量。 通过同源重组的手段构建得到了4株产乳酸途径中ldhA基因插入缺失突变株，突变株的乳酸脱氢酶活性比亲株大幅度降低，突变株LDH1的酶活最高，为亲株的6.92％，LDH3的酶活最低，为亲株的3.65％。将突变株LDH3应用于1,3-丙二醇发酵，在厌氧条件下，所能达到的1，3-丙二醇浓度、甘油的转化率和生产强度较野生型菌株依次提高了45％、29％和32％；在微氧条件下，所能达到的1,3-丙二醇浓度、甘油的转化率和生产强度较野生型菌株依次提高了58％、22％和21％；且在发酵过程中都不产生乳酸。此外，高价值副产物2,3-丁二醇的浓度在厌氧和微氧条件下分别比野生型菌株提高了73％和39％。 在发酵初始添加10gl-1蔗糖可以最大程度提高1,3-丙二醇的生产强度；以8∶1(甘油：蔗糖)的比例补料可以最大程度提高甘油转化率。用突变株LDH3结合微氧和添加蔗糖的补料批式发酵，1，3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度比最初的野生型厌氧发酵依次提高了113％、51％和122％，2,3-丁二醇浓度提高了10倍以上。 通过同源重组的手段得到了6株产乙醇途径中多效基因adhE插入缺失突变株，突变株乙醛脱氢酶活性均为亲株的10％以下，其中突变株ADH5的活性最低，仅为亲株酶活的4.18％；6个突变株的乙醇脱氢酶活性相差不大，均为亲株酶活的10％左右。将突变株ADH5应用于发酵中，与野生型菌株相比，甘油转化率有所提高，但1,3-丙二醇浓度和生产强度却降低了，这是因为在底物和还原力的竞争中，1,3-丙二醇途径明显弱于乳酸途径所致。过量表达1，3-丙二醇途径中甘油脱水酶的基因dhaB和阻断乳酸产生途径有望改变这种不利状况。 将突变株ADH5和LDH3应用于2,3-丁二醇发酵，在批式发酵中，突变株ADH5的产物浓度、葡萄糖的转化率和生产强度依次比K.oxytocaM5al提高了36％、15％和39％；突变株LDH3的产物浓度、葡萄糖转化率和生产强度依次比K.oxytocaM5al提高了40％、17.5％和46％。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

第一章 文献综述

第二章 材料和方法

第三章 通气量对产酸克氏杆菌产生1，3-丙二醇的影响

第四章 微氧发酵液中2,3-丁二醇的定性和定量分析

第五章 ldhA基因的克隆及ldhA缺失突变株的构建和发酵

第六章 加糖对ldhA缺失突变株产生1，3-丙二醇的影响

第七章 产乙醇途径中多效基因adhE缺失突变株的构建和发酵

第八章 产酸克氏杆菌突变株产生2，3-丁二醇的研究

第九章 实验总结

参考文献

致谢

附录

作者简历