葡萄果实查耳酮合成酶研究——基因克隆、表达、纯化、抗体的制备以及UV、糖对葡萄果实查耳酮合成酶的调节

摘要

查耳酮合成酶(CHS，E.C.23.1.74)是植物类黄酮代谢途径的入口酶，也是此途径的第一个关键限制酶，它参与了以C<,15>为基本骨架的类黄酮物质的形成，它在研究植物类黄酮代谢途径调控机制具有十分关键的作用。本文通过构建chs原核表达载体进行原核表达，分离纯化得到高纯度的CHS蛋白。通过免疫兔子制备多克隆抗体，并对血清进行了分离纯化，得到了葡萄中CHS特异性多克隆抗体。抗体在葡萄不同组织部位均检测到一条43 kD的蛋白条带。并在此基础上探讨了查耳酮合成酶在葡萄果实的亚细胞定位以及UV、蔗糖处理对葡萄果实CHS的调控机制，为进一步研究葡萄果实中查耳酮合成酶在类黄酮代谢途径中的生理功能奠定了良好的实验和理论基础。 采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对葡萄chs基因全序列进行扩增，扩增产物直接连接到克隆载体pMD18-T，并转化大肠杆菌DH5α。经过蓝白斑筛选、小量提取质粒进行酶切鉴定以及基因测序鉴定得到chs全长基因，命名为pMK-chs。 通过使用限制性内切酶(EcRⅠ和Sal Ⅰ)将质粒pMD-chs进行双酶切，得到带有双酶切粘性末端的chs基因片断，同样方法处理表达载体pET-30a(+)。两基因片段纯化后用T<,4>DNA连接酶进行定向连接，得到重组质粒，命名为pET)<,2>SO<,4>分级沉淀、DEAE-Sepharose FF离子交换层析纯化，得到抗体lgG。纯化后的抗体通过酶联免疫、蛋白质斑点杂交和Western blot分析，表明具有良好的效价和较高的灵敏度与特异性。葡萄果实不同组织部位和果实发育过程中的CHS的蛋白质免疫印迹分析表明，抗体均能特异性地检测到一条431 kD的蛋白条带。在葡萄果实发育过程中，幼果期CHS蛋白含量很低，进入转色期开始大量增加，这种状态一直持续到果实成熟采收。 以盛花后70 d的赤霞珠(Vitis viniferα.L.cv.Cabernet Sauvienon)果实为试材，应用紫外线(UV)照射技术，研究了UV照射对葡萄果实类黄酮代谢产物的影响。同时应用胶体金免疫电子显微镜操作技术首次对CHS在葡萄果实(果皮和果肉)内进行了亚细胞定位。结果表明UV诱导了果实类黄酮代谢产物(总酚、总类黄酮、总花色苷)的大量合成，类黄酮代谢入口酶一查耳酮合成酶转录水平和蛋白含量明显增加。胶体金免疫电镜显示，CHS主要存在于葡萄果实细胞的质体(叶绿体、有色体)、细胞质、次生壁、粗糙内质网，在细胞壁和液泡中含量分布较少。 以幼果期(20 d)和转色期(70 d)赤霞珠葡萄果实为试材，应用糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)渗透完整果实的实验体系，研究了糖处理对葡萄果实类黄酮代谢的影响。结果表明，外施蔗糖处理促进了葡萄果实总酚、总类黄酮和总花色苷的合成。RT-PCR研究表明，蔗糖处理明显诱导了chs基因的转录，Western blotting试验证明了糖处理促进了CHS蛋白的合成。

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文摘

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论文说明：缩略语表

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第一章文献综述

第二章PCR扩增葡萄CHS全长基因及其序列分析

摘要

2.1材料与试剂

2.1.1目的基因

2.1.2载体与菌株

2.1.3主要试剂与耗材

2.1.4主要试剂的配制

2.2实验方法

2.2.1葡萄查耳酮合成酶基因cDNA鉴定

2.2.2 PCR扩增chs全长基因

2.2.3凝胶回收PCR扩增产物

2.2.4构建克隆载体pMD-chs

2.2.5重组粒转化DH5 α感受态细胞

2.2.6重组质粒的鉴定

2.3结果与分析

2.3.1质粒的小量提取与酶切鉴定

2.3.2 PCR克隆chs全基因

2.3.3 PCR产物的凝胶回收

2.3.4 pMD-chs载体的构建

2.3.5重组质粒pMD-chs的转化与鉴定

2.4讨论

第三章表达载体pTE-chs的构建、原核表达以及亲和纯化目的蛋白

摘要

3.1材料与试剂

3.1.1菌株和质粒

3.1.2主要试剂

3.1.3主要溶液的配制

3.2实验方法

3.2.1用EcoRⅠ和SalⅠ酶切克隆载体pMD-chs和表达载体pET-30a(+)

3.2.2目的片断和载体pET-30a的回收和纯化

3.2.3构建表达载体PET-chs

3.2.4重组质粒pET-chs转化BL21

3.2.5 IPTG诱导转化菌株表达目的蛋白

3.2.6细胞总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

3.2.7蛋白质纯化方案

3.2.8 Western blotting免疫检测纯化蛋白

3.3结果与分析

3.3.1双酶切目的基因和表达载体

3.3.2构建原核表达载体pET-chs

3.3.3重组表达载体的鉴定

3.3.4 IPTG诱导pET-chs的原核表达

3.3.5融合蛋白的纯化与免疫检测

3.4讨论

第四章葡萄查耳酮合成酶(CHS)多克隆抗体的制备与纯化

摘要

4.1材料与试剂

4.1.1材料

4.1.2试剂

4.1.3主要溶液的配制

4.2实验方法

4.2.1多克隆抗体制备方案

4.2.2纯化方案

4.2.3酶联免疫分析(ELISA)

4.2.4 Western blotting分析

4.2.5 Protein dot blot分析

4.3结果与分析

4.3.1查耳酮合成酶抗血清纯化各阶段获得的抗体组分的SDS-PAGE分析

4.3.2 ELISA分析和抗原滴度

4.3.3抗体特异性及在葡萄果实发育过程中的蛋白质免疫印迹分析

4.4讨论

第五章UV线照射对葡萄果实chs基因的诱导作用及其亚细胞定位

摘要

5.1材料与试剂

5.1.1实验材料

5.1.2实验仪器

5.1.3主要试剂

5.1.4主要溶液的配制

5.2实验方法

5.2.1转色期葡萄果实UV照射

5.2.2 Western blotting分析

5.2.3葡萄果实中酚类物质含量测定

5.2.4葡萄果实RNA的提取与纯化

5.2.5引物设计

5.2.6 RT-PCR反应

5.2.7 CHS在葡萄果实发育过程中的亚细胞定位

5.3结果与分析

5.3.1紫外处理对葡萄果实酚类物质的影响

5.3.2紫外处理对转色期葡萄果实CHS蛋白含量的影响

5.3.3紫外诱导chs基因转录水平的变化

5.3.4葡萄果实发育过程中CHS的亚细胞定位

5.4讨论

第六章糖对葡萄果实花色苷形成的影响

摘要

6.1材料和试剂

6.1.1植物材料

6.1.2主要试剂

6.1.3溶液的配制

6.2实验方法

6.2.1葡萄果实发育过程中糖含量的测定

6.2.2葡萄糖、果糖、蔗糖渗透处理采后完整葡萄果实

6.2.3蛋白质含量测定

6.2.4总酚、总类黄酮以及花色苷含量测定

6.2.5 RNA提取与纯化

6.2.6RT-PCR

6.2.7 CHS的Western blotting分析

6.3结果与分析

6.3.1葡萄果实发育过程中糖含量变化

6.3.2糖渗透处理对葡萄果实类黄酮代谢酚类物质的影响

6.3.3糖渗透处理对葡萄果实chs基因的转录水平的影响

6.3.4糖渗透处理对葡萄果实CHS蛋白含量的影响

6.4讨论

第七章结论

参考文献

致谢

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