当归红芪超滤膜提取物联合直线加速器照射抑制人肝癌SMMC-7721细胞实验研究

摘要

目的：通过医用直线加速器产生的X射线一次性照射体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞，构建辐射模型。探讨当归红芪超滤物对于直线加速器辐射前后人肝癌SMMC-7721细胞及其Caspase-3蛋白酶表达的影响，进一步探讨二者联合诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡，为应用当归红芪超滤膜提取物辅助临床放疗增敏治疗肿瘤提供实验依据。
　　方法：取密度为1×105个/mL人肝癌SMMC-7721细胞用于实验。实验分为10组，其中1个对照组（Z）即正常对照组，1个纯辐射组（R）给以源皮距100cm4Gy的X射线，另设4个纯药物组，分别设A、B、C、D四个药物浓度梯度为：2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml。依据药物浓度梯度由低到高，分别设4个辐射加药组为：E、F、G、H，同样给以源皮距100cm4Gy的X射线。光学显微镜下观察细胞形态；利用电子透镜观察细胞超微结构；采用MTT法检测细胞生长抑制率；用流式细胞仪检测细胞周期变化；并通过Caspase-3酶活性检测试剂盒，采用分光光度法检测细胞裂解液中Caspase-3酶活性。
　　结果：倒置显微镜观察，正常组细胞形态呈多边形，生长密集，呈鱼鳞状排列，胞质透明，核仁清晰规则，细胞膜完整光滑；单纯辐射组外形并无明显改变，但密度明显下降；辐射加药 G组（6mg/ml）细胞变化最为明显细胞体积明显缩小，呈圆形，细胞数量明显减少，细胞轮廓不清。透射电镜观察，正常组细胞形态规则，核染色质分布均匀，核仁清晰，细胞膜完整；单纯辐射组细胞形态基本完整，细胞核浓缩，出现核边集现象，细胞膜皱缩粗糙不光滑，出现少量空泡，细胞凋亡特征明显；辐射加药 G组（6mg/ml）细胞凋亡特征更为明显，核浓缩变形，边集明显，核膜皱褶，细胞线粒体进一步肿大空化，空泡变性加重，内质网扩张空化甚而崩解，有细胞自噬现象发生，细胞形态改变明显，细胞膜变形明显，不完整；MTT法检测结果：经当归红芪超滤物作用后的肝癌细胞其OD值降低并呈时间依赖关系（P<0.05）。提示其对于人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制增殖作用。辐射加药组细胞的OD值较单纯辐射组明显降低（P<0.05），表明辐射联合药物能进一步抑制细胞的活性，起到诱导细胞凋亡的作用，尤其是辐射加药G组对于人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制增殖作用更为明显（P<0.01），具有较好的辐射增敏作用。流式结果显示：4Gy X射线辐射后24h可使肝癌细胞G0/G1期细胞数量明显增多，由44.8％升至71.8％（P<0.01），药物组也可以使G0/G1期细胞比例有所升高（P<0.05），辐射加药G组细胞G0/G1期比例为87.9％阻滞最为明显（P<0.01）。Caspase-3酶活性检测结果显示：辐射加药物 G组（6mg/ml）细胞Caspase-3酶活性较纯辐射组细胞明显增强（P<0.01）。
　　结论：当归红芪超滤膜提取物物（10万分子量）对人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制生长作用，联合直线加速器照射对人肝癌SMMC-7721细胞有一定的诱导凋亡作用。并可以作为辐射增敏剂一定程度上提高肿瘤细胞对于X射线的敏感性。

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缩 略 词 表

前 言

一 立 题 依 据

1 放射治疗的作用机制

1.1 放疗机制

1.2 肿瘤吸收剂量

1.3 肿瘤细胞的变化

1.4 放射治疗与PHC

2 肿瘤的产生与凋亡

2.1 肿瘤的产生

2.2 肿瘤的凋亡

3 当归、红芪的药理作用

3.1 当归的主要药理作用

3.2 红芪的主要药理作用

4 当归补血汤的主要药理作用

4.1 当归补血汤的中医学理论背景

4.2 抗肿瘤作用

4.3 对血液系统的作用

4.4 保护心脑血管作用

4.5 对免疫系统的作用

4.6 抗氧化作用

4.7 保肝作用

5 祖国医学对肝癌的认识

5.1 单味中药抗肿瘤

5.2 中药复方抗肿瘤

6 祖国医学对辐射增敏的研究

6.1 放射增敏中药的选择

6.2 单味中药的增敏作用

6.3 中药复合制剂的增敏作用

7 现代医学对辐射增敏的认识

7.1 细胞DNA损伤修复与放射增敏

7.2 细胞的氧合状态与放射增敏

7.3 细胞亲电子性化合物与放射增敏

7.4 通过影响细胞周期动力学实现放射增敏

8 超滤膜技术的可行性

9 评述与展望

二 实 验 研 究

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 统计学分析

3 结 果

3.1 当归红芪超滤物及辐射对细胞形态学的影响

3.2 当归红芪超滤物对人肝癌SMMC-7721细胞增殖活力的影响

3.3 当归红芪超滤物联合辐射对人肝癌SMMC-7721细胞增殖活力的影响

3.4 不同时间段当归红芪超滤物联合辐射对人肝癌SMMC-7721细胞增殖活力的影响

3.5 当归红芪超滤物及辐射对细胞周期分布的影响

3.6 当归红芪超滤物及辐射对细胞Caspase-3酶活性的影响

3.7 当归红芪超滤物对人肝癌SMMC-7721细胞的辐射增敏作用

三 讨 论

1 细胞复苏的方法

2 消化对细胞的影响

3 当归红芪超滤物联合直线加速器照射诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡作用

4 当归红芪超滤物对人肝癌SMMC-7721细胞的辐射增敏作用

四 结 语

1 结论

2 体会与展望

参考文献

致谢

附 录1

附 录2

附 录3

附 录4 攻读硕士期间发表的论文