南极产低温植酸酶菌的分离、产酶条件优化及酶学性质研究

摘要

植酸酶作为一种绿色饲料添加剂，能够有效提高饲料中植酸磷的利用率，降低植酸的抗营养作用，从而降低生产成本，并能够缓解粪磷排泄所造成的环境污染，在饲料行业中已经得到广泛应用。现在应用的植酸酶大多为中高温植酸酶，与低温植酸酶相比它们在低温下活性较低，而单胃动物的生理温度在39℃左右，在水产养殖业中通常需要植酸酶在低于28℃具有较高的催化活性。因此，低温植酸酶具有巨大的潜在应用价值。 本研究通过两步筛选法从南极深海沉积物样品中分离出10株产植酸酶菌株，其中一株具有较高的植酸酶活性，命名为JMUY14。经形态学、生理生化和26S rRNA ITS区序列系统发育分析鉴定为红酵母属（Rhodotorula sp.）。据我们所知，这是首次有关红酵母属产植酸酶的报导。 采用单因素试验和响应面试验设计相结合的方法对Rhodotorula sp.JMUY14的产酶条件进行了优化，结果如下:葡萄糖4％，蛋白胨2％，NaNO31.5％，KCl0.025％，MgSO4·7H2O0.025％，MnSO4·H2O0.002％，FeSO4·7H2O0.002％，发酵时间48h，发酵温度25℃，培养基初始pH5.0，接种量10％。通过对单因素试验结果进行分析，选取发酵温度(℃)、接种量(％)和蛋白胨添加量(％)为显著因子进行Box-Behnken Design(BBD)，结果如下:在发酵温度26℃，接种量10.4％，蛋白胨添加量2.3％的条件下，植酸酶产量达到205.447U/ml，与软件预测的植酸酶产量201.948U/ml基本一致，比优化前大约提高了3.4倍。 通过硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤层析对Rhodotorula sp.JMUY14的胞外植酸酶进行了分离纯化，纯化倍数和回收率分别为15.16和5％，植酸酶的比活达到31635U/mg。Rhodotorula sp.JMUY14的植酸酶具有以下特性:(1)等电点为4.33，分子量为63 kDa;(2)最适温度为50℃，在10℃和37℃分别保留17.5％和85％的酶活，表明其在低温下具有较高的活性;在45℃和50℃孵育50min分别保留64.8％和41％的酶活，55℃处理10min、20min、30min、40min、50min分别保留45.7％、36.2％、22.9％、21.0％、12.4％的酶活，60℃或65℃处理10min酶活基本丧失;(3)最适pH为5.0，在pH2.0-8.0稳定性较好，适于在单胃动物胃肠道中发挥作用;(4)Mg2+、Fe2+、Fe3+、K+、Na+、Ca2+、EDTA和EGTA能够增强植酸酶的活性;Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ag+、PMSF、Phenylgloxal hydrate和SDS能够抑制植酸酶的活性，其中Phenylgloxal hydrate是组氨酸酸性磷酸酶的特异性抑制剂。因此，Rhodotorula sp.JMUY14的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶(HAP)家族;(5)在0.1mg/ml的胃蛋白酶和胰蛋白酶溶液中37℃孵育1h，剩余酶活分别为92.2％和75.6％，表明它具有较强的蛋白酶抗性;(6)植酸酶对植酸的Km和Vmax值分别为0.247mM和0.0265mM/min，对植酸钠的Km和Vmax值分别为0.817mM和0.0218mM/min，表明该植酸酶对植酸具有较高的亲和力。

目录

声明

摘要

主要符号表

第1章 前言

1．1 南极微生物简介

1．1．1 南极微生物的多样性

1．1．2 低温微生物的特征

1．1．3 低温微生物的应用

1．2 微生物低温酶及其应用研究进展

1．2．1 低温酶的结构特征

1．2．2 新型低温酶的筛选

1．2．3 低温酶的改造

1．2．4 低温酶在生物技术领域的应用

1．3 植酸酶及其应用研究进展

1．3．1 植酸

1．3．2 植酸酶的定义

1．3．3 植酸酶的来源

1．3．4 植酸酶的分类

1．3．5 植酸酶的性质

1．3．6 植酸酶的作用机制

1．3．7 植酸酶领域的研究热点

1．3．8 植酸酶的应用

1．3．9 植酸酶的发展趋势

1．3．10 植酸酶活性测定方法

1．3．11 低温植酸酶研究进展

1．4 本研究的目的和意义

第2章 南极产低温植酸酶菌株的筛选及鉴定

2．1 材料与方法

2．1．1 样品

2．1．2 主要试剂

2．1．3 培养基

2．1．4 主要仪器设备

2．1．5 植酸酶活力的测定

2．1．6 产植酸酶菌株的筛选

2．1．7 菌种鉴定

2．2 实验结果

2．2．1 磷标准曲线

2．2．2 产植酸酶菌株的筛选

2．2．3 菌种鉴定

2．3 讨论

2．4 小结

第3章 菌株JMUY14产酶条件的优化

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株

3．1．2 培养基

3．1．3 主要化学试剂

3．1．4 种子液的培养

3．1．5 粗酶液的制备及酶活测定

3．1．6 单因素试验

3．1．7 筛选显著因子

3．1．8 响应面试验设计(RSM)

3．2 实验结果

3．2．1 单因素试验

3．2．2 筛选显著因子

3．2．3 响应面试验设计(RSM)结果

3．3 讨论

3．4 小结

第4章 植酸酶的分离纯化及酶学性质研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株

4．1．2 培养基

4．1．3 主要试剂

4．1．4 仪器

4．1．5 蛋白质含量的测定

4．1．6 SDS-PAGE及银染

4．1．7 Rhodotorula sp．JMUY14植酸酶的分离纯化

4．1．8 Rhodotorula sp．JMUY14植酸酶的性质研究

4．2 实验结果

4．2．1 蛋白质标准曲线

4．2．2 Rhodotorula sp．JMUY14植酸酶的纯化

4．2．3 Rhodotorula sp．JMUY14植酸酶的性质

4．3 讨论

4．4 小结

第5章 本论文的创新点与研究展望

5．1 本论文的研究总结

5．2 本论文的创新点

5．3 本论文的研究展望

致谢

参考文献

附录

在学期间发表的学术论文