仿刺参消化道中产酶菌株的筛选鉴定及其在仿刺参饲料中的应用

摘要

从仿刺参(A.Japonicus)消化道中筛选出3株菌株，通过形态特征、生理生化特征和16SrDNA分子这三方面鉴定它们分别为:解淀粉芽孢杆菌X3-3(Bacillus amyloliquefaciensX3-3)、甲基营养型芽孢杆菌X4-1（Bacillus methylotrophicusX4-1）和巨大芽孢杆菌X4-5(Bacillus megateriumX4-5)。其中解淀粉酶芽孢杆菌X3-3和甲基营养型芽孢杆菌X4-1这两株细菌分泌消化酶活性较高，巨大芽孢杆菌X4-5则净水效果较好。通过单因素控制实验得出解淀粉酶芽孢杆菌X3-3和甲基营养型芽孢杆菌X4-1的最佳生长和产酶条件:解淀粉芽孢杆菌X3-3的最适生长温度34℃-37℃，最适初始pH为8.0，最适盐度为30。甲基营养型芽孢杆菌X4-1的最适生长温度为37℃，最适初始pH为7.0-8.0，最适盐度为30。在水质净化分析方面，采用萘乙二胺分光光度法测定水质中亚硝酸盐含量，用靛酚蓝分光光度法测定氨氮含量，结果表明，巨大芽孢杆菌X4-5在改善养殖水质方面具有潜在的应用价值。
　　研判这三株菌作为益生菌的实验包括各种安全性检测:对仿刺参消化道细胞的粘附作用、测定微生物对斑马鱼（Zebra fish，Danio rerio）毒性的饲养实验、针对病原菌的拮抗实验。结果表明，在以模式动物斑马鱼为宿主的攻毒试验中，与对照组相比较，实验组成活率没有发生显著变化，且成活率都高于90％;这三株菌在仿刺参消化道细胞中的粘附率都高于85％，说明这三种细菌对仿刺参消化道细胞有较好的粘附能力，能够在宿主肠道内栖息定植;在菌株调节肠道微生态方面，这3株菌均能够与假单胞菌和副溶血弧茵等致病菌产生拮抗作用。
　　以1％剂量添加于饲料中的实验结果表明，解淀粉芽孢杆菌X3-3无论是单独使用还是与巨大芽孢杆菌X4-5或/和甲基营养型芽孢杆菌X4-1联合使用皆能显著(P＜0.05)提升仿刺参的生长和消化酶活，30d和60d的检测结果差异不明显（P＞0.05）;三种菌制剂的联合使用在显著提升仿刺参体腔液AKP、 ACP、 SOD、 LZM和POD等体液免疫相关因子活性水平效果优于两种菌的配伍使用（P＜0.05），且除了解淀粉芽孢杆菌X3-3，与单一菌制剂相比，两两配伍的复合菌制剂对机体相关指标影响较大，差异显著(P＜0.05)。综合分析，效果最好的微生态制剂为三者联合使用的复合菌制剂，能显著提升仿刺参特定生长率、消化酶活性和免疫相关因子水平，具有开发应用价值。

目录

声明

摘要

第1章 引言

1．1 益生菌在海参养殖中的应用

1．1．1 产酶益生菌的国内外研究

1．1．2 益生菌与水质净化

1．1．3 海参免疫机能

1．2 技术路线

第2章 2株产消化酶菌株的筛选

2．1 实验材料

2．2 方法

2．2．1 菌株的筛选

2．2．2 淀粉酶和蛋白酶酶活的测定

2．2．3 革兰氏染色

2．2．4 生理生化实验

2．2．5 DNA提取

2．3 实验结果

2．3．1 样品酶活力测定

2．3．2 菌株酶活

2．3．3 革兰氏染色

2．3．4 生理生化结果

2．3．5 16S rDNA同源性序列分析

2．4 讨论

2．5 结论

第3章 1株巨大芽孢杆菌的筛选鉴定

3．1 实验材料

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂和仪器

3．2 实验方法

3．2．1 菌株的筛选

3．2．2 富集与保种

3．2．3 初步鉴定

3．2．4 生长曲线

3．2．5 16S rDNA

3．2．6 净水效果研究

3．3 实验结果

3．3．1 外观形态特征和生理生化鉴定结果

3．3．2 生长曲线

3．3．3 测序结果

3．3．4 水质净化结果

3．4 讨论

3．5 结论

第4章 2株产酶菌培养条件的优化

4．1 实验材料

4．2 实验方法

4．2．1 生长曲线与酶活曲线

4．2．2 不同温度对细菌的影响

4．2．3 不同pH对细菌的影响

4．2．4 不同盐度对细菌影响

4．3 实验结果

4．3．1 生长曲线与酶活曲线

4．3．2 最适温度测定

4．3．3 最适pH测定

4．3．4 最适盐度测定

4．4 讨论

4．5 结论

第5章 3株潜在益生菌的益生特性检测

5．1 实验材料

5．2 实验方法

5．2．1 细菌对肠道细胞的粘附作用

5．2．2 菌株毒性检测

5．2．3 与致病菌的拮抗作用

5．3 实验结果

5．3．1 细菌对肠道细胞的粘附作用

5．3．2 菌株毒性检测

5．3．3 与致病菌的拮抗作用

5．4 讨论

5．5 结论

第6章 3株潜在益生菌对仿刺参的影响

6．1 实验材料

6．2 菌制剂配伍

6．3 饲养管理

6．4 生长和消化酶指标测定

6．5 非特异性免疫指标测定

6．5．1 酸性磷酸酶

6．5．2 碱性磷酸酶

6．5．3 溶菌酶

6．5．4 超氧化物歧化酶

6．5．5 过氧化物酶

6．6 结果

6．6．1 特定生长率和消化酶

6．6．2 仿刺参免疫酶活性

6．7 讨论

6．8 结论

第7章 结论

致谢

参考文献

在学期间发表的学术论文