深海管状蠕虫Ridgeia piscesae和中华鲎Tachpleus tridentatus Pax6基因的功能研究

摘要

Pax6基因首先是在小鼠和人中克隆得到的，它编码的转录因子在脊椎动物和无脊椎动物中都相当保守，并且在动物的眼睛，胸腺，以及中枢神经系统发育中都发挥了重要作用。Pax6基因能调节多种下游基因的表达，Pax6突变能导致多种症状，如人类无虹膜、瞳孔异位、角膜炎、神经发育紊乱、视神经发育不良等，鼠小眼畸形(small eye)，果蝇眼睛缺失(eyeless)等。
　　本论文主要对已经克隆得到的生活在深海热液区的管状蠕虫Pax6基因以及对海洋动物活化石-中华鲎的Pax6基因进行功能分析。主要的研究结果如下：
　　1.序列比对分析：将已经克隆并测序正确的一个管状蠕虫的Pax6基因和4个中华鲎的Pax6基因的的蛋白序列分别与果蝇的Pax6基因ey/toy以及果蝇的Pax基因eyg/toe的蛋白序列比对。又由Pax6基因的蛋白序列建构的人、斑马鱼、果蝇、中华鲎、线虫和管状蠕虫的进化树分析可知，管状蠕虫Pax6基因和果蝇的Pax6基因ey/toy有较高的同源性，它们Paried domain同源性为：93.75％，Homeo domain同源性为93.10%；中华鲎Pax6a、Pax6b与果蝇的Pax6基因ey/toy有较高的同源性，它们Paried domain同源性为：95.71%，Homeo domain同源性为87.30%；中华鲎Pax6c、Pax6d与果蝇的Pax基因eyg/toe有较高的同源性，它们Paried domain同源性为：80.96%，Homeo domain同源性为90.68%。
　　2.管状蠕虫Pax6基因的功能分析：为了研究Pax6基因的功能，我们充分利用模式生物果蝇来作为研究工具。我们利用通过显微注射技术得到的一株深海管状蠕虫转基因果蝇来研究管状蠕虫的Pax6基因。根据UAS/GAL4体系在果蝇体内研究Pax6基因的功能。我们把得到的深海管状蠕虫的转基因果蝇分别和与眼睛发育有关的ey-GAL4、GMR-GAL4以及与全身发育有关的da-GAL4、dpp-GAL4品系果蝇杂交，得到了在不同组织中过表达的管状蠕虫Pax6基因的后代果蝇，通过观察在果蝇不同组织过表达R.piscesae Pax6的果蝇，发现UAS-RpPax6/ey-GAL4果蝇头部缺失，出现无头表型，UAS-RpPax6/GMR-GAL4果蝇眼睛中部缺失，出现粗糙眼表型；UAS-RpPax6/dpp-GAL4果蝇在三龄幼虫时期死亡；UAS-RpPax6/da-GAL4果蝇在胚胎期死亡。这些异常表型表明管状蠕虫Pax6基因能影响果蝇眼睛，头部等部位发育。我们又解剖了UAS-RpPax6/ey-GAL4三龄幼虫时期果蝇幼虫的成虫盘，发现其眼睛成虫盘几乎完全缺失，而眼睛成虫盘又是发育成头部结构的重要组织，进一步证明了管状蠕虫Pax6基因在果蝇体内过表达能影响果蝇眼睛头部发育。
　　3.为了探索管状蠕虫Pax6基因在果蝇眼睛中过表达导致眼睛异常的可能的分子机理，我们选取果蝇Pax6（ey）基因的下游靶基因sine oculis（so）的启动子进行荧光素酶报告基因检测实验，由检测结果可知管状蠕虫Pax6表达的蛋白在293T细胞中不能激活so的启动子。此外，我们用管状蠕虫Pax6基因的C端与果蝇ey基因的C端相互替换进行上述荧光素酶报告基因检测实验。由荧光素酶报告基因检测实验结果可知替换后的eyN+RpPax6C表达的蛋白与ey表达的蛋白相比在293T细胞中so的启动子的活性降低。而RpPax6N+eyC表达的蛋白与RpPax6表达的蛋白相比在293T细胞中so启动子的活性升高。
　　4．为了研究RpPax6在果蝇发育过程中是否引起了凋亡，我们充分利用果蝇模型，选取管状蠕虫Pax6转基因果蝇和温度敏感型果蝇da-GAL4,tub-GAL80杂交，先在18 ℃环境下培养，然后转到29 ℃培养箱培养。解剖后代三龄幼虫的成虫盘并用吖啶橙染色，在显微镜下观察发现与实验空白组相比，管状蠕虫Pax6转基因果蝇的翅膀和眼睛成虫盘出现明显凋亡表型，说明了RpPax6确实引起了果蝇细胞的凋亡。为了补救由于管状蠕虫Pax6经过ey-Gal4/TM6B,Tb过表达后表现出的缺失大部分头部的表型，我们选取了UAS-P35果蝇进行补救实验，UAS-P35果蝇株先后与转基因果蝇UAS-RpPax6和ey-GAL4杂交。后代：UAS-P35/+;UAS-RpPax6/ey-Gal4有6%出现了头部结构，但是没有眼睛，剩余的94%仍为无头表型。
　　5.我们利用同样的方法研究了中华鲎Pax6转基因果蝇的功能，并最终发现这些果蝇在眼睛，腿部等结构都出现了异常表型。为了补救由于中华鲎Pax6经过ey-GAL4/TM6B,Tb过表达后表现出的异常表型，我们选取了UAS-P35果蝇来补救其中一株中华鲎Pax6c转基因果蝇实验，先后与转基因果蝇UAS-TtPax6c和ey-GAL4杂交。后代：UAS-P35/+;UAS-TtPax6c/ey-Gal4全部出现头部，并出现小眼表型。说明了中华鲎Pax6基因能引起果蝇的细胞凋亡从而进一步影响果蝇眼睛等结构的发育。
　　Pax6基因编码蛋白广泛存在动物中，在机体眼睛发育、中枢神经系统发育等生理病理过程中起关键的调控作用，对有活化石之称的中华鲎以及深海热液区管状蠕虫的Pax6的功能研究有助于了解海洋动物Pax6基因在发育过程中的作用。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 前言

1.1深海管状蠕虫简介

1.1.1 深海生物简介

1.1.2 深海管状蠕虫简介

1.2中华鲎简介

1.3模式动物果蝇

1.3.1 果蝇简介

1.3.2 果蝇的眼睛发育及相关基因

1.3.3 果蝇中的UAS/GAL4和UAS/GAL80表达系统

1.3.4果蝇中的平衡染色体

1.4 Pax6基因结构和功能

1.4.1 Pax基因简介

1.4.2 Pax6基因

1.5 论文立题的背景和研究意义

第二章 材料与方法

2.1 实验相关药品和试剂

2.2主要仪器

2.3部分试剂配方:

2.4分子生物学相关实验方法

2.4.1质粒载体介绍

2.4.2 总RNA提取

2.4.3大肠杆菌感受态的制备

2.4.4 DNA转化

2.4.5质粒DNA提取

2.4.6 DNA回收

2.4.7 DNA连接（LIC）

2.4.8 PCR相关实验

2.5 细胞相关实验和方法

2.5.1 细胞培养

2.5.2 细胞转染

2.6 果蝇相关实验方法

2.6.1果蝇饲养

2.6.2果蝇培养基的配制方法（1 L）

2.6.3果蝇DNA提取方法

2.6.4果蝇total RNA提取

2.6.5果蝇成虫总蛋白的提取

第三章 结果与分析

3.1管状蠕虫R.piscesae的Pax6基因的序列分析

3.2 中华鲎T.tridentatus 的Pax6基因的序列分析

3.3管状蠕虫Pax6的功能分析

3.3.1管状蠕虫Pax6在果蝇体内过表达

3.3.2 管状蠕虫Pax6的表达能引起果蝇的细胞凋亡

3.3.3管状蠕虫Pax6能抑制so启动子的活性

3.4中华鲎Pax6基因的功能分析

3.4.1 中华鲎Pax6基因转基因果蝇分别与dpp-GAL4、ey-GAL4和GMR-GAL4品系果蝇杂交

3.4.2中华鲎Pax6b能抑制so启动子的活性

第四章 讨论

附录A：文中几个基因的氨基酸序列

附录B:其它比对结果

参考文献

致谢