北极表层海水中氯代十六烷降解菌的多样性分析及Alteromonas sp. P127的基因组和多环芳烃降解机制研究

摘要

本论文包括两部分内容,即北极表层海水中氯代十六烷降解菌的多样性分析与多环芳烃降解菌Alteromonas sp. P127的基因组分析和多环芳烃降解机制研究。
　　为了研究北极地区表层海水中氯代十六烷(C16H33Cl)降解菌的多样性,并获得新的卤代烃降解菌资源。本研究以C16H33Cl为唯一碳源和能源在4℃和25℃下对表层海水样品进行富集,通过平板分离鉴定可培养菌株,并验证其降解能力；同时利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析降解菌群结构。从 12 个北极表层海水样品中富集分离得到112株可培养菌株。经过降解实验验证,发现19株菌株能够降解氯代十六烷,其中食烷菌(Alcanivorax)、红球菌(Rhodococcus)表现出很好的乳化和降解现象,海杆菌(Marinobacter)也有较好的降解效果。DGGE分析显示,富集驯化的降解菌群中主要优势菌为 Alcanivorax,Parvibaculum 和Thioclava 属的菌株。北极海水中卤代烃降解菌主要是 α-proteobacteria ,γ-proteobacteria,Actinobacteria 和 Bacteroidetes。本研究首次报道了北极海水卤代烷烃降解菌多样性,研究结果对于认识北极环境中的降解菌资源与生物多样性有参考价值。
　　Alteromonas sp.P127 是从大西洋深海海水以萘、菲、蒽和芘四种多环芳烃(PAHs)为混合碳源经富集培养而分离得到的一株革兰氏阴性菌。碳源实验表明,该菌可以利用苯甲酸以及萘、菲、芘、2-甲基萘、氧芴、4-甲基硫芴作为唯一碳源和能源生长,并且P127是交替单胞菌属深海来源的菌株中第一个被发现具有PAHs降解能力的。经过对该菌株的基因组测序,获得基因组草图约4.9 Mb,预测有4538个ORF,68个tRNA,5个rRNA操纵子,GC含量为44.8%。经过比较基因组分析,P127 菌株基因组具有一些深海来源细菌常有的基因组特征,如大量的IS序列、转座子和噬菌体相关基因。P127比深海来源的交替单胞菌A. macleodii‗Deep ecotype‘(AltDE)基因组多约500 Kb,P127基因组特有4个主要基因簇：包含PAHs降解基因的基因簇(nag)、包含接合元件的基因簇(ice)、包含氢化酶合成基因的基因簇(hy2)、包含苯甲酸降解基因的基因簇(ben)。这些基因簇以基因岛的形式存在于P127染色体上,很可能都是菌株通过基因水平转移获得的。重金属抗性实验表明该菌株与深海型的交替单胞菌的重金属抗性一致,比表层型交替单胞菌具有更好的重金属抗性。
　　经反转录半定量PCR分析,PAHs降解基因簇主要包含两个操纵子和两个调节基因,PAHs起始双加氧酶基因所在操纵子受萘诱导。这两个操纵子分别位于基因组DNA的两条不同的链上,它们的转录方向相反。位于PAHs起始双加氧酶基因所在操纵子最后的ORF0231是一个膜蛋白,它的N端包含信号肽区域是一个外膜转运蛋白,可能参与PAHs的转运,其结构与大肠杆菌的长链脂肪酸转运蛋白FadL类似。通过缺失突变对菌株PAHs降解基因簇的关键基因PAHs起始双加氧酶大亚基基因orf0227、两个调节因子基因orf0218和orf0219、外膜蛋白基因 orf0231 进行缺失突变,orf0227 的突变导致该菌丧失 PAHs 降解能力, orf0218和orf0231的突变株表观上对PAHs的降解没有影响,但是orf0218的缺失使得菌株对氧芴的降解率有所提高,表明它是一个负调控因子,orf0231的突变对氧芴的降解率几乎没有影响；而orf0219没有突变成功。而苯甲酸降解基因簇的相关降解基因排布紧凑、新颖,包含从苯甲酸到儿茶酚以及儿茶酚邻位裂解再经β-ketoadipate途径进入TCA循环的全部基因。
　　这部分研究通过基因组分析发现了P127菌株深海环境适应的一些基因基础,包括有利于基因组进化的可转移元件,重金属抗性相关基因,PAHs、苯甲酸、H2等营养物质利用的基因基础。并且通过反转录 PCR 和缺失突变验证了 PAHs降解基因的功能,但是对于PAHs降解基因的调控机制和PAHs的吸收转运机制还没有阐述清晰。这部分研究加深了对Alteromonas sp.P127环境适应性和PAHs降解特性的认识,研究结果对于认识深海PAHs降解机制和特殊降解菌的环境作用有参考价值。同时,对于开发利用深海污染物降解微生物资源,为PAHs污染的生物治理、生物监测以及生物催化剂的开发和应用提供帮助。

目录

封面

声明

中文摘要

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英文摘要

1 前言

1.1 卤代烷烃的危害及其降解微生物研究概况

1.1.1 卤代烷烃的来源及危害

1.1.2 卤代烷烃降解微生物的研究

1.2 极地环境石油烃降解菌的研究概况

1.3 多环芳烃的微生物降解研究进展

1.3.1 多环芳烃的来源及危害

1.3.2 多环芳烃降解微生物

1.3.3 多环芳烃降解基因及其调节机制研究

1.3.4 多环芳烃降解菌的基因组学研究

1.4 微生物吸收和转运多环芳烃的研究进展

1.4.1 多环芳烃的吸收转运机制

1.4.2 微生物PAHs吸收与转运相关基因的研究

1.4.3 FadL家族芳烃转运膜蛋白的研究

1.5 菌株Alteromonas sp.P127的研究进展

1.6 本文的研究目的及意义

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 样品来源

2.1.2 菌株与载体

2.1.3 主要试剂和药品

2.1.4 主要仪器

2.1.5 常用溶液和培养基

2.1.6 PCR扩增引物

2.1.7 所使用的分析软件

2.2 基本方法

2.2.1 细菌基因组DNA的提取

2.2.2 PCR反应扩增体系

2.2.3 PCR扩增程序

2.2.4 PCR产物的纯化

2.2.5 DNA的沉淀

2.2.6 琼脂糖凝胶DNA片段回收

2.2.7 感受态细胞E. coli DH5α的制备

2.2.8 DNA连接反应

2.2.9 Exonuclease III介导的LIC

2.2.10 质粒的化学转化

2.2.11 菌落PCR检测克隆子

2.2.12 变性梯度凝胶电泳(DGGE)制胶

2.2.13 16S rDNA V3区PCR

2.3 北极表层海水中氯代十六烷降解菌的多样性分析方法

2.3.1 降解菌群富集培养

2.3.2 降解单菌分离鉴定

2.3.3 单菌降解能力定性分析

2.3.4 16S rDNA的鉴定与系统发育树的构建

2.3.5 降解菌群结构DGGE分析

2.4 菌株Alteromonas sp. P127的基因组测序及多环芳烃降解机制研究方法

2.4.1 菌株P127基因组测序及基因预测与注释

2.4.2 多环芳烃降解率的测定

2.4.3 反转录PCR

2.4.4 双亲接合转移缺失突变

2.4.5 重金属抗性实验

3 结果与讨论

3.1 北极表层海水中氯代十六烷降解菌的多样性分析

3.1.1 降解菌群的菌株分离与鉴定

3.1.2 可培养单菌的系统进化分析

3.1.3 菌株C16H33Cl降解能力验证

3.1.4 降解菌群DGGE分析

3.1.5 讨论

3.2 多环芳烃降解菌Alteromonas sp. P127的基因组分析

3.2.1 菌株P127基因组概况

3.2.2 比较基因组分析

3.2.3 重金属抗性分析

3.2.4 讨论

3.3 Alteromonas sp. P127多环芳烃降解机制研究

3.3.1 PAHs降解基因簇的比对分析结果

3.3.2 苯甲酸降解基因簇的比对分析

3.3.3 PAHs降解基因的突变研究

3.3.4 讨论

4 小结与展望

参考文献

致谢

附录