具有抗真菌活性的光亲和标记探针的设计、合成及其功能研究

摘要

近二十年来，深部真菌感染的发生率及死亡率呈快速增长趋势，而目前临床上常用的抗真菌药物存在疗效有限、毒副作用大、抗菌谱窄和易产生耐药性等问题，其中真菌的耐药性成为深部侵袭性真菌感染治疗失败的主要原因。我们前期已经发现小檗碱、连翘酯苷A、芒果苷、黄芩素等天然小分子化合物都具有协同氟康唑抗耐药真菌活性，与氟康唑联合应用，能显著提高氟康唑的抗耐药真菌活性，而且他们有相近的体内外药效，相似的药效基团，但由于作用机制不清，作用靶点不明，严重阻碍了以此为基础的新型抗真菌药物研究。此外，两药协同抗耐药真菌过程中，氮唑类抗真菌药物的分布和外排有待进一步的研究与确证。
　　光亲和标记(PAL)技术是用于确证、分离和表征新型生物分子及潜在药物靶点的有效和可靠工具，特别用于未知靶点的发现。因此，我们采用PAL-CC-ABPP(Photoaffinitylabeling click chemistry activity-based protein profiling)技术将上述化合物做成光亲和探针，为后期运用生物正交技术、生物信息学技术、基因组学技术研究药物靶点奠定基础。在前期针对小檗碱类探针分子进行的靶点探测的研究基础上，本课题基于光亲和标记技术对另一类协同抗真菌剂黄芩素及氮唑类抗真菌药物进行探针化设计合成，并对其应用做了初步研究:
　　(1)设计合成三氟甲基苯基二氮杂环丙烯类光亲和标记基团中间体TPD-6，TPD-6a，TPD-6b，TPD-10a，TPD-10b，TPD-10c，TPD-A，TSL-7，并通过NMR、MS确认其结构。
　　(2)以具有协同氟康唑抗耐药真菌活性的黄芩素为活性基团、三氟甲基苯基二氮杂环丙烯为光亲和标记基团、苄溴为反应基团、丙炔基团为潜在的报告基团，设计、合成了探针分子BE-1、BE-2、BE-4、BE-5、BE-6，并通过NMR、MS确认其结构。活性测试结果表明，BE-2与氟康唑(1μg/ml)联用，对耐药白念珠菌(103)的MIC80为4μg/ml，两药合用的FICI值为0.039。BE-5与氟康唑(0.25μg/ml)联用的MIC80为8μg/ml，两药合用的FICI值为0.065，表明BE-2及BE-5都有较好的协同氟康唑抗耐药白念珠菌活性，可作为活性探针用于后续研究。
　　(3)利用近几年报道的带有活性卡宾及香豆素前体的新型原位标签生成的探针技术，设计合成了BE-3，通过NMR、MS确认其结构，活性测试结果与BE-2相当，其与氟康唑(1μg/ml)联用对耐药白念珠菌(103)的MIC80为4μg/ml，两药合用的FICI值为0.039，证明其为活性探针。
　　(4)以三氟甲基苯基二氮杂环丙烯为光亲和标记基团，以三氮唑类抗真菌活性类似物为母体，设计合成了氮唑类小分子探针FCZ-GB、FCZ-1、FCZ-2、FCZ-3、FCZ-4，并进行了体外抗真菌活性测试，测得FCZ-GB、FCZ-3、FCZ-4对白念珠菌(Y0109)的MIC80值分别为:0.25μg/ml、4μg/ml、0.5μg/ml，可作为活性的氮唑类抗真菌药物探针。
　　为了对设计合成的探针分子的功能进行初步的评估，我们首先将BE-2探针分子与白念珠菌的全蛋白提取液进行蛋白结合的初步研究。SDS-PAGE结果显示，蛋白出现特异性条带，证实了BE-2具有蛋白结合功能和与荧光分子成像示踪动能，具备用于后续靶点研究的可行性。将出现的特异性条带作初步的质谱分析，结果显示半胱氨酸或赖氨酸可能为BE-2结合在靶蛋白上的氨基酸残基。以上实验为BE-3及BE-5的应用奠定基础。另外，FCZ-GB用以进行结合靶蛋白的质谱分析，对于FCZ-3及FCZ-4可结合光亲和标记及生物正交成像技术做下一步的靶点信息探测。
　　本课题设计合成了具有协同氟康唑抗耐药真菌活性的黄芩素类光亲和探针和具有抗真菌活性的氮唑类光亲和探针，为两类化合物的系统抗耐药机制和作用靶点研究奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1 抗耐药真菌药物研究现状

2 基于光亲和标记的小分子探针技术

第二章 课题设计

第三章 化学实验部分

1 试剂与仪器

1．1 溶剂与原料

1．2 分析测试仪器及测试条件

2 光亲和标记小分子探针的合成

2．1 光亲和片段的合成

2．2 目标探针分子的合成

2．3 药理实验中Click反应的体外验证

2．4 药理实验中光解时间的体外验证

2．5 部分化合物的结构与表征

第四章 药理实验

1 探针分子抗耐药白念珠菌作用活性测试

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 实验结果

2 小分子探针捕获靶点的初步研究

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 实验结果

第五章 小结与讨论

参考文献

附录

致谢

文献综述 具有协同抗耐药真菌活性的天然小分子化合物研究进展

作者简历