穿膜肽联合盐霉素磷脂胶束靶向肿瘤干细胞的实验研究

摘要

在肿瘤中不仅存在着普通肿瘤细胞，还存在着与肿瘤发生，复发和转移关系密切的肿瘤干细胞，它是原始肿瘤细胞[1]。因此，成功清除肿瘤干细胞对肿瘤治疗起着重要作用。众多癌症中，肝癌是目前最常见恶性肿瘤之一，过去三十年中，在美国肝癌发病率增长了90％。由于肝癌的扩散迅速以及转移率高，五年的肝癌复发率从40％上升到70％。近年来肝癌肿瘤干细胞的研究开始引起人们的注意。众多研究表明肿瘤干细胞可以比普通肝癌细胞更能抵御传统化疗方法。盐霉素是一种离子载体抗生素，并有报道其可以清除多种肿瘤干细胞[2]}。在盐霉素被广泛认为可以杀伤肿瘤干细胞的同时，研究还发现其对肝癌和前列腺癌普通细胞具有很好的杀伤效果。因此，由于盐霉素能同时杀伤肝癌细胞和干细胞，所以其在肝癌治疗上具有很强的应用前景[3-5]。
　　本研究论文的研究内容如下:
　　第一章，建立了可靠的SAL检测方法，实验结果表明，SAL浓度在7.82～1000μg·mL-1范围内与样品峰面积A呈良好相关性(r=0.999)，直线回归方程:A=940.43C+16584。高、中、低三个浓度日内精密度和日间精密度RSD均小于5％，满足体外检测要求。
　　第二章，通过偶联法将-iRGD中巯基与DSPE-PEG2000-MAI中马来酰亚胺反应生成DSPE-PEG2000-iRGD，通过MALDI-TOF-MS鉴定DSPE-PEG2000-iRGD的成功合成。考察了DSPE-PEG2000-iRGD胶束的粒径，zeta电位和形态结构，并优化了胶束的制备条件。结果表明药物与材料质量比为1∶10时包封率较好(96.64％)，粒径较小(13nm左右)。M-SAL-iRGD在pH=5.0和pH7.4的条件下，SAL均呈两相释放，在pH=5.0条件下释放较快。
　　第三章，以NRP-1高表达的HepG2细胞和HepG2肝癌干细胞为模型，以1，2-二油酰基甘油-甘油-3-磷酸氨基乙醇-氮-（羧基二乙酸荧光素）(CFPE)为荧光探针穿插在DSPE-PEG2000-iRGD胶束中，考察胶束的体外NRP-1受体靶向性。结果表明M-CFPE-iRGD胶束在HepG2细胞和HepG2肝癌干细胞摄取明显强于未接穿膜肽的M-CFPE。即M-CFPE-iRGD可以很好的被细胞摄取的能力。另外，本章还评价了两种胶束细胞中细胞毒性，和微球体形成率。结果表明空白胶束对肝癌细胞和肝癌干细胞均无毒性，而M-SAL-iRGD可增加对两种细胞的毒性，且可抑制HepG2微球体的形成。
　　第四章，建立了HepG2荷瘤裸鼠模型，制备出包载荧光探针DiR的DSPE-PEG2000-iRGD胶束，评价其在体内分布和肝癌肿瘤靶向性。结果表明 M-DiR-iRGD胶束主要分布在肝和肿瘤组织中，并在肿瘤组织中的聚集多于其它组织。说明M-DiR-iRGD具有很好的肿瘤靶向与肿瘤渗透性。采用HPLC-MS分析了游离SAL、M-SAL胶束和M-SAL-iRGD胶束在SD大鼠中的药代动力学特征。结果表明两种胶束均可延缓SAL在血浆中的消除，其中M-SAL-iRGD能更有效地延缓SAL从血循环中的清除，增长其循环时间。建立HepG2荷瘤裸鼠模型，评价了游离SAL，M-SAL胶束和M-SAL-iRGD的体内抗肝癌活性及体内肿瘤微球体形成率。结果显示M-SAL-iRGD组具有最强的肿瘤抑制能力，且能明显降低体内肝癌肿瘤微球体形成率。
　　综上所述，M-SAL-iRGD可以很好抑制肝癌及肝癌干细胞，具有较好的开发和应用前景。

目录

声明

缩略词

摘要

前言

第一章 SAL含量测定方法的建立

1．仪器与材料

2．实验方法

2．1 HPLC色谱条件

2．2 特异性

2．3 线性范围

2．4 提取回收率

2．5 精密度

3．实验结果

3．1 特异性

3．2 线性范围

3．3 提取回收率

3．4 精密度

4．小结与讨论

第二章 胶束的制备及表征

1．仪器与材料

2．实验方法

2．1 M-SAL胶束的制备

2．2 M-SAL-iRGD胶束的制备

2．3 材料及胶束的表征

3．实验结果

3．1 不同材料与药物比例对胶束粒径，Zeta电位，包封率，载药量的影响

3．2 胶束的表征

4．小结与讨论

第三章 胶束的体外细胞学研究

1．仪器与材料

2．实验方法

2．1 载CFPE胶束的制备

2．2 肿瘤细胞与肿瘤干细胞的培养

2．3 NRP-1受体靶向性评价

2．4 证明胶束的体外细胞结合活性

2．5 激光共聚焦证明胶束的体外细胞结合活性

2．6 CCK-8法对载药系统的体外细胞毒性评价

2．7 胶束体外抗肝癌干细胞活性

3．实验结果

3．1 HepG2肿瘤细胞与干细胞表面NRP-1表达分析

3．2 激光共聚焦证明胶束的体外细胞结合活性

3．3 CCK-8法对载药系统的体外细胞毒性评价

3．4 胶束体外抗肝癌干细胞活性

4．小结与讨论

第四章 胶束的体内药代动力学

1．仪器和材料

2．实验方法

2．1．血浆样品预处理

2．2．盐霉素HPLC-MS分析方法学的建立

2．3．血药浓度的测定

3．实验结果

3．1．SAL HPLC-MS定量分析方法学的建立

3．2．药代动力学

4．小结与讨论

第五章 胶束的体内靶向性研究

1．仪器和材料

2．实验方法

2．1．DiR紫外-可见定量方法学的建立

2．2．活体成像观察胶束的靶向性

2．3．肿瘤冰冻切片观察荧光胶束靶向性

3．实验结果

3．1．DiR紫外-可见定量方法学考察

3．2．活体成像观察胶束的靶向性

3．3．肿瘤冰冻切片观察荧光胶束靶向性

4．小结与讨论

第六章 胶束的体内抗肿瘤活性

1．仪器和材料

2．实验方法

2．1．人肝癌肿瘤移植模型的建立

2．2．体内抗肝癌干细胞活性评价

3．实验结果

3．1．体内抗肿瘤活性评价

3．2．系统毒性评价

3．3．体内抗肝癌干细胞活性评价

4．小结与讨论

结论

参考文献

致谢

文献综述 盐霉素靶向肿瘤干细胞的研究

作者简历