皮质骨和其它不同来源兔成骨细胞的体外培养和生物学特性比较

摘要

目的：通过比较皮质骨和其它不同来源兔成骨细胞的体外培养和部分成骨功能，鉴定并探讨不同来源成骨细胞的成骨能力，通过皮质骨块连续两次植块培养和相关检测，探讨皮质骨连续植块培养的可行性。 方法：手术取3月龄新西兰大白兔（雌雄不限）上肢皮质骨、髂骨、骨膜、骨髓分别用组织块法和酶消化法培养获取细胞，骨髓采用密度梯度离心法提取干细胞、检测时经成骨诱导，每天用倒置相差显微镜观察细胞形态、贴壁及生长情况，并用差速贴壁法纯化细胞。将细胞分为皮质骨组、骨膜组、松质骨组、干细胞诱导组和干细胞常规组。取不同来源的第3代（P3）细胞进行如下实验，结晶紫染色比较细胞形态、MTT法测定细胞增殖曲线、对硝基酚法测碱性磷酸酶（ALP）活性、酶免法测定骨钙素（BGP）等，取原代培养传代后的皮质骨块进行二次组织块培养，获取第4代（P4）细胞进行实验，比较两次连续植块细胞的增殖和ALP、BGP表达能力，多余的细胞进行冻存保种。将各种数据进行统计学分析，以均数±标准差（X±S）表示，采用成组t检验和单因素方差分析检验，P<0．05有统计学意义。 结果： 1、形态学观察：不同来源的细胞形态差别不大。原代培养松质骨组细胞和皮质骨组细胞基本呈长梭形、放射状排列于组织块周围，骨膜组细胞呈梭形、三角形，部分松质骨组细胞胞体稍扁、突起较长，皮质骨组细胞突起略短，骨膜组细胞突起偏短，干细胞形状不规则，呈梭形、多边形，突起较多、较短。传代后不同来源的细胞形态趋于一致，干细胞经诱导后形状更加规则，和其他来源的细胞类似，呈长梭形、角形及不规则形等。皮质骨两次植块培养的细胞形态学上无明显差异。 2、增殖情况：不同来源的P3细胞生长呈一致的类S型曲线；细胞倍增时间，骨膜组和干细胞常规组约为5天，干细胞诱导组为7天，皮质骨和松质骨组介于其中，为6天，然后逐渐进入平台期。增殖速度，第1天，各组无差别，第3天开始干细胞诱导组即落后于皮质骨组、骨膜组、松质骨组和干细胞常规组，而后四组之间并无明显差别，第5天和第7天，皮质骨组和松质骨组仍无差别，但二者均落后于骨膜组和干细胞常规组，其中只有松质骨组落后于骨膜组和干细胞常规组有统计学意义，骨膜组和干细胞常规组无增殖差别；皮质骨两次连续植块细胞的增殖速度无明显差异。 3、成骨能力 （1）碱性磷酸酶（ALP）活性：皮质骨组、骨膜组、松质骨组和干细胞诱导组随着培养时间的延长，吸光值增大，即ALP活性均增高，培养初中期增殖幅度逐渐增加，后期增幅减慢，而干细胞常规组则未见明显ALP表达。皮质骨组、骨膜组、松质骨组和干细胞诱导组的ALP活性比较：第7天，骨膜组即高于松质骨组、干细胞诱导组，骨膜组和皮质骨组之间、松质骨组和干细胞诱导组之间均无明显差异；第12天，骨膜组>皮质骨组>松质骨组>干细胞诱导组；第20天，骨膜组和皮质骨组无统计学差异，二者均强于松质骨组和干细胞诱导组，其中松质骨组>干细胞诱导组；第28天，骨膜组>皮质骨组>松质骨组>干细胞诱导组。皮质骨两次连续植块细胞的ALP表达无明显差异。 （2）骨钙素（BGP）活性：皮质骨组、骨膜组、松质骨组和干细胞诱导组的BGP活性亦随时间而增强，随培养时间延长而增殖幅度逐渐增加，干细胞常规组基本没有表达BGP；第12、20天，骨膜组>皮质骨组>松质骨组>干细胞诱导组；第28天，骨膜组>松质骨组>干细胞诱导组，其中，骨膜组和皮质骨组之间、皮质骨组和松质骨组之间均无统计学差异。皮质骨两次连续植块细胞的BGP活性无明显差异。 结论： 1、皮质骨、骨膜、松质骨、骨髓干细胞均可以培养出成骨细胞。不同来源的成骨细胞形态学上无显著差别，呈长梭形、三角形或者不规则形。 2、不同来源的细胞增殖能力比较如下：骨膜组和干细胞常规组增殖较快，皮质骨组和松质骨组居中（二者之间无统计学差别），干细胞诱导组增殖最慢。干细胞常规组无明显成骨能力。不同来源的成骨细胞成骨能力比较如下：骨膜组>皮质骨组>松质骨组>干细胞诱导组。 3、皮质骨来源的成骨细胞成分相对单纯，两次连续植块细胞的生物学特性无差别，可以进行连续植块培养以重复利用骨块，达到节省经费、节约时间的目的。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

1材料

1.1实验动物

1.2课题基金来源及实验场所条件

1.3主要试剂与仪器

1.4取材用品

1.5溶液配制

附表

2实验步骤

2.1细胞培养

2.2不同来源细胞的成骨鉴定及其增殖和成骨功能比较

2.3比较皮质骨连续两次植块培养细胞的增殖和成骨功能

2.4细胞冻存

2.5统计学处理

3结果

3.1形态学观察

3.2不同来源细胞的增殖和成骨表达情况

3.3皮质骨连续植块细胞的增殖和成骨能力

4讨论

4.1不同来源细胞的增殖和成骨功能

4.2细胞培养方法

4.3连续植块法

4.4成骨细胞的纯化和冻存

4.5干细胞的分离和诱导

4.6细胞的密度效应及污染的防治

4.7祖国医学促进成骨理论

5结论

6总结

参考文献

致谢

附录：主要英文缩略词表

附图

综述：成骨细胞培养研究进展

作者简介