hVEGF-165和hBMP-2真核共表达载体的构建及其转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响

摘要

颅颌面部骨缺损是平、战时意外事故的常见伤类。骨形态发生蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)对骨原细胞的分化起主要的决定性作用，是促进成骨的重要因子；血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)是新近发现的在创伤愈合过程中促进血管再生发挥着重要作用的生长因子。本研究在创建颅骨缺损动物模型的基础上，采用免疫组化及原位杂交技术，动态观察了创伤后组织中BMP2、4及VEGF的变化。应用分子克隆和转基因技术，构建了hVEGF165与hBMP2真核细胞共表达载体——pIRES-hBMP2-hVEGF165，并应用组织工程技术进行人骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)的分离和培养，在传代后采用阳离子脂质体介导的转染方式，将外源VEGF165及hBMP2cDNA导入BMSCs，使其正常表达，以提高BMSCs的成骨能力，提供改良骨组织工程种子细胞，从而促进骨创伤愈合过程。本实验通过免疫组化、免疫印记、RT-PCR等方法检测基因转染后BMSC中的VEGF165、BMP2蛋白质骨钙素mRNA的表达程度，同时也观察了对BMSCI型胶原表达及碱性磷酸酶活性的影响。 结果发现：VEGF在颅骨缺损后骨缺损3天时，骨缺损端内软骨细胞和成骨细胞呈阳性表达，基质内呈弱阳性表达，1周表达逐渐减弱；2周时表达增强，3周时软骨细胞分裂增生，呈团状排列，表达达到高峰，呈强阳性，4周时减弱，5周时仍可见部分细胞呈阳性。BMP2在骨缺损3天后，骨缺损端可见散在分布的未分化间充质细胞及细胞间质呈阳性。1周时原始骨痂成骨细胞、骨端骨细胞、新形成的软骨基质呈阳性。肉芽组织间质呈阳性。2周呈弱阳性，3周时，新形成得软骨细胞出现阳性染色，软骨基质也呈阳性。幼稚软骨细胞、骨痂表面成骨细胞呈阳性，4周时减弱，5周时仍可见部分细胞呈阳性。BMP4mRNA在缺损后1周，骨折间充质细胞呈阳性，3周时表达明显增强，4周时减弱，其余时间点未见表达。 构建的重组质粒pIRES-hBMP2-hVEGF165经酶切和电泳及测序鉴定后证明构建正确。基因转染后BMSC能检测到BMP2和hVEGF165蛋白分泌量明显升高，促进BMSC合成Ⅰ型胶原，提高其碱性磷酸酶活性以及骨钙素mRNA的表达程度与对照组相比，非常显著。这说明： 1.VEGF在颅骨缺损创伤后的表达与创伤愈合过程中新生血管形成的时间相似，说明VEGF参与调节了骨创伤愈合过程中的血管再生阶段，对毛细血管的发生有积极促进作用。 2.VEGF和BMP参与颅面部骨创伤愈合过程中的不同阶段，二者有协同作用，VEGF刺激血管再生的启动，并诱导BMP的合成。 3.构建的pIRES-hBMP2-hVEGF165真核细胞表达载体质粒能够顺利以阳离子脂质体的方法转染到BMSC中，使外源性BMP2、VEGF165基因稳定表达。 4.VEGF165、BMP2联合基因修饰的BMSC向成骨细胞定向分化的能力增强。 5.本实验建立的在体外基因转染的方法，为骨组织工程种子细胞的改良提供了实验依据。

目录

缩略词对照表

文献综述：与颅颌面部骨骼重建有关的骨生长因子及相关基因治疗研究进展

一、生长因子

二、基因治疗技术

三、问题与展望

第一部分：BMP-2、VEGF在颅骨缺损修复过程中的表达及意义

前言

材料与方法

结果

附图1

附图2

讨论

第二部分：hBMP2和hVEGF165真核共表达载体的构建及鉴定

前言

材料与方法

结果

讨论

第三部分：人骨髓间充质干细胞的分离、培养及向成骨细胞的诱导分化

前言

材料与方法

结果

讨论

附图

第四部分：pIRES-hBMP2-hVEGF165重组质粒体外转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响

前言

材料和方法

结果

讨论

附图

全文总结

参考文献

致谢