柔嫩艾美耳球虫A08基因的阶段表达分析与毕赤酵母表达系统构建

摘要

对A08蛋白基因在柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段（未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子）的转录情况进行分析，同时以A08蛋白cDNA为模板扩增出1 083 bp的目的基因片段，将该基因连接到pGEM-T-easy载体上，经序列测定和双酶切鉴定表明为A08基因。用EcoR I和Not I酶切回收目的片段连接至用同样酶切的真核表达载体pPIC9k上，构建了重组质粒pPIC9k-A08，转化大肠杆菌TOP10后，提取质粒，经酶切鉴定正确后用Sac I将重组质粒线性化，再电转入毕赤酵母GS115菌株，G418筛选抗性重组子，经PCR鉴定正确重组子后做甲醇诱导表达。RT-PCR结果显示该基因在子孢子阶段的转录拷贝数显著高于其他发育阶段，是一个子孢子高表达基因。重组酵母诱导表达产物经SDS-PAGE检测证实，柔嫩艾美耳球虫A08基因在毕赤酵母中获得表达。Western blot初步分析表明，表达产物具有免疫学反应活性。