A型产气荚膜梭菌α毒素的提纯鉴定及其基因的克隆

摘要

为了对A型产气荚膜梭菌α毒素快速准确地做出检测,本实验应用的A型产气荚膜梭菌的标准菌株CVCC38,利用厌氧肉肝汤培养A型产气荚膜梭菌,经革兰染色观察以及含铁牛奶培养基观察其生化特性.然后使用饱和度为60％的硫酸铵粗提其α毒素蛋白,进行透析纯化并应用SDS-PAGE方法鉴定A型产气荚膜梭菌的α毒素,鉴定之后将纯化的α毒素给小鼠腹腔注射来检测其活性.果表明，厌氧肉肝汤培养基变浑浊且产生大量气体，含铁牛奶培养基发生爆烈发酵现象，革兰染色镜检可见到一种呈阳性的粗大杆菌，菌体两端钝圆，多单个存在，有荚膜，很少见到芽胞，可确定所培养细菌为产气荚膜梭菌；SDS-PAGE检测结果，α毒素分子量为43.6kDa，实验组小鼠出现梭菌病的典型临床症状。此外，根据Gene Bank上已发表的CVCC38 A型产气荚膜梭菌序列设计1对引物对α毒素基因进行克隆，菌落PCR成功扩增出1127bp α毒素基因片段。本实验中所提供的检测产气荚膜梭菌方法具有灵敏、快速、简便等优点而且具有实践意义。产气荚膜梭菌主要致死性毒素的毒性，主要取决于毒素质粒的存在和缺失，由于α毒素是产气荚膜梭菌的主要致死性毒力因子和保护性抗原。所以从分子生物学角度对该毒素的研究具有重要实际意义，并且将对该毒素引起的疾病的预防和诊治起到极大的作用。本实验中将产气荚膜梭菌α毒素经硫酸铵盐析、透析脱盐后，能够较好地提纯α毒素，可以作为一种毒素蛋白的提纯、检测方法，并由此可确定产气荚膜梭菌的毒素类型。该方法能对α毒素进行提纯并获得纯化的毒素，表明通过该方法既除去了大量的杂蛋白和其他物质，又保证了毒素蛋白的质量浓度，最终获得了较纯的产气荚膜梭菌α毒素。此次试验中对饱和度为60%硫酸铵沉淀的α毒素进行实验室快速提取与纯化，并将复性后的α毒素注射小鼠，小白鼠出现腹痛，腹泻并迅速死亡典型临床症状，说明复性的α毒素可直接用于下一步研究。可以进一步获得丧失生物毒性但具有良好免疫原性的α毒素，从而为研制α毒素基因工程亚单位疫苗研制提供理想材料。为进一步开展梭菌毒素的致病机理及制备类毒素疫苗奠定重要的实验基础。