基因多位点整合提高毕赤酵母表达重组FSH的量

摘要

目的:以巴斯德毕赤酵母为蛋白表达系统,通过基因组多位点的整合,提高FSH基因的拷贝数,提高FSH在毕赤酵母中的表达量,延长FSH在动物体内的半衰期.rn 方法:经过密码子优化的FSHα和β亚基串联构建在两个表达框中,并插入载体pPIC9K、pPICZαA和pGAPZαA中,然后转化毕赤酵母GS115和KM71两个菌株,鉴定FSH适合表达的Mut表型和阳性转化子,并小试发酵,用Western Blot检测FSH是否表达;将表达FSH的菌株作为感受态,转化pGAPZαA-FSH,筛选阳性转化子,用菌液PCR、Western Blot等手段检测目的载体是否整合.将整合的阳性转化子小试发酵,用HEK293-FSHR细胞检测上清中蛋白的活性,ELISA测量上清中FSH的含量,SDS-PAGE胶检测目的带所占上清蛋白的比例.在此基础上,在FSHβ的C端添加CTP或N端添加N-糖基化位点,并构建在上述三个载体中,表达FSH,检测活性,小试发酵,并用Ni柱纯化蛋白样品,超排动物,观察动物排卵情况,卵母细胞质量及状态,用ELISA检测血液中FSH的浓度,计算半衰期是否延长.将表达长效重组FSH的菌株进行扩大培养,摸索工业生产的参数(培养基的组成,温度,湿度等环境因素),提高毕赤酵母表达长效重组FSH的产量.rn 预期结果:(1)重组FSH的半衰期平均65h左右,单次注射的剂量相当于市售猪FSH的8次注射的量,超排动物能明显提高卵母细胞的质量;(2)毕赤酵母分泌表达FSH的产量达500mg/l的水平.rn 创新点:在毕赤酵母中分泌表达长效FSH,并将FSH整合到基因组的不同位置,提高FSH基因的拷贝数,从而提高FSH的表达量.