牛支原体、巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌多重PCR快速检测方法的建立

摘要

本实验旨在建立一种多重PCR方法，用于同时鉴别牛支原体和两种常见混合感染菌。分别针对多杀性巴氏杆菌A型特异的hyaC—hyaD基因区段、化脓隐秘杆菌的16S rRNA基因上保守区段和牛支原体的UvrC基因设计特异性引物，多重PCR的最佳扩增条件确定为：95℃ 10分钟预变性后;95℃ 1min，56℃ 50s，72℃ 1min，循环30次;72℃ 10分钟进行延伸反应。特异性试验证明，该多重PCR可同时扩增出以上三种致病菌的特异性片段，不能扩增出其他病原菌的相关片段;敏感性试验证明可检测到多杀性巴氏杆菌A型、化脓隐秘杆菌和牛支原体的最低浓度分别为8×105CFU／mL，8×105CFU／mL和4×106CFU／mL。用该方法检测了牛支原体肺炎患牛的鼻拭子与肺组织，发现12 h预增菌后肺组织检测与牛支原体培养的阳性符合率为92％。鉴于对临床样本进行牛支原体分离培养需要3-4天时间，而该多重PCR结合12h预增菌，能在24h内出结果，显著加快了临床诊断速度，具有推广应用价值。