鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

摘要

为实现对鸭圆环病毒(DuCV)的快速检测需要,依据GenBank中登录的DuCV全基因组序列分析比对,在其保守区设计并合成一对特异性引物,并将相应的212bp片段克隆到pMD-18T载体中,获得pMD18DuCV重组质粒,通过SYBR GreenⅠ荧光掺入法分别对系列稀释pMD18DuCV中DuCV特异性片段进行扩增,通过pMD18DuCV浓度对数与Ct值制作了标准曲线并推导出直线回归方程,二者相关系数(R2)为0.9968,建立了DuCV实时荧光定量PCR检测方法,经过重复性和灵敏性检测,结果表明重复性良好,检测下限为67.2拷贝/μL;将建立的DuCV实时荧光定量PCR检测方法分别对鸭肝炎病毒(DHV)、大肠杆菌、新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感、小鹅瘟病毒(GPV)核酸或cDNA进行特异性检测,结果表明特异性良好.初步应用结果表明,建立的DuCV实时荧光定量PCR方法检出率为26.4％(62/235),较常规PCR方法检出率15.3％(36/235)高11.1％,明显优于常规PCR检测结果.