Excessive Human Serum Albumin Might Weaken Anticancer Effect of Cisplatin and Etoposide (HSA Weaken Anticancer Effect)

摘要

目的：人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)的滥用在中国无论是发达地区还是偏远落后地区这种现象都极为常见.癌症患者也经常选择使用HSA.然而,过度的使用HSA对化疗药物产生何种影响目前尚不清楚.通过本研究希望：探究过量人血清白蛋白如何影响顺铂、依托泊苷的抗肿瘤作用及具体机制. 方法：(1)利用CCK-8法检测HSA对化疗药物增殖抑制作用的影响.稀释DDP母液至0、1、5、10、15、20μmol/L的工作浓度;稀释VP-16至0、2.5、5、10、20μmol/L;HSA用完全培养基溶解配制浓度为10、20μmol/L.进行CCK-8实验,药物作用72h后检验A549细胞的增殖抑制率,细胞增殖抑制率大于50％范围内选择DDP和VP-16的适宜浓度10μmol/L作为联合用药浓度.选取HSA联合用药浓度10、20μmol/L进行CCK-8实验.根据CCK-8实验结果将实验分为单独用药组：空白组、VP-16组、DDP组、HSA组;联合用药组：VP-16和DDP联合10μmol/LHSA(VP-16/DDP+HSA(10μmol/L))、VP-16和DDP联合20μmol/L的HSA(VP-16/DDP+HSA(20μmol/L)).(2)流式细胞术(FCM)分析HSA对化疗药物凋亡作用的影响.各个药物组分别经药物处理24h和48h后,AnnexinV-PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较各单独用药组与联合用药组细胞凋亡率差异显著性.(3)细胞迁移实验测定肿瘤细胞迁移率的改变.各药物组处理48h后,用transwell小室进行细胞迁移实验,迁移时间为24h,结晶紫染色后显微镜下观察各药物处理组之间细胞迁移情况.(4)LC-MS/MS测定过量HSA对细胞内化疗药物浓度的影响.各药物处理组作用12h后,萃取细胞内药物,比较各组间细胞内药物浓度差别.(5)实时荧光定量PCR和免疫印迹法探究细胞内的药物敏感基因突变基因ERCC1和TOP2AmRNA-蛋白表达的改变.各个药物处理组(同上)作用72h后,提取总蛋白用免疫蛋白印迹(Western blot)方法从分子水平检测药物敏感基因突变基因ERCC1、TOP2A蛋白的表达情况.提取细胞总RNA进行实时定量PCR(quantitative real time PCR,QRT-PCR)实验.(6)皮下注射LLC肺癌细胞进行肺癌造模,10天后造模成功,测量小鼠体重和移植瘤体积,选择体重和移植瘤体积相似的36只小鼠作为实验小鼠,实验分为12组,每组6只小鼠.首先给予造模小鼠不同剂量的白蛋白,每日给药,三天后,于次日检测血液中白蛋白水平,并开始给予化疗药物治疗.自用药开始,每五天测量小鼠体重,共用药21天,检测化疗药物与过量HSA联合使用前后各药物作用组小鼠体重改变;用药结束后测量各组小鼠的移植瘤体积,进行组间比较;用药结束后次日,剥离移植瘤,对各组离体移植瘤进行称重,计算抑瘤率,并分析各组HSA联合用药前后两药的联合效应. 结果：(1)CCK-8检测结果显示过量HSA减弱了DDP和VP-16对A549细胞的增殖抑制作用.VP-16/DDP+HSA(10μmol/L)的增殖抑制率分别是62.49％±1.50％/67.51％±2.58％,VP-16/DDP+HSA(20μmol/L))的增殖抑制率分别是62.10％±2.10％/64.99％±4.99％,联合用药组的增殖抑制率明显低于单独用药组VP-16/DDP(65.20％±5.20％/(73.04％±73.0％)(P＜0.05).(2)流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡表明,HSA单独作用几乎不能引起细胞凋亡(1.98％±0.59％、1.81％±0.16％),DDP和VP-16能明显引起细胞凋亡.与DDP和VP-16单独作用相比,过量HSA(DDP-HSA和VP-16-HSA)能明显降低细胞凋亡,并且这种弱化作用呈剂量依赖.VP-16单独用药组药物作用24/48h的细胞凋亡率分别为19.70％±0.99％/34.79％±1.92％,而联合用药组VP-16+HSA(10μmol/L)细胞凋亡率分别为13.21％±0.56％/29.19％±1.04％,联合用药组VP-16+HSA(20μmol/L)细胞凋亡率为9.89％±0.68％/22.28％±1.40％(P＜0.05).DDP单独用药组药物作用24/48h的细胞凋亡率为31.50％±0.95％/40.15％±0.69％,而联合用药组DDP+HSA(10μmol/L)细胞凋亡率为22.70％±2.21％/35.22％±0.40％,联合用药组DDP+HSA(20μmol/L)细胞凋亡率为17.89％±0.53％/33.28％±1.89％,三者之间差异具有统计学意义(P＜0.05).(3)与DDP/VP-16单独用药相比,合并过量HSA增加了癌细胞的迁移和克隆形成率,同时降低了DDP/VP-16的细胞内药物浓度.Western blot和实时荧光定量PCR检测表明HSA增强了药物敏感基因突变基因ERCC1和TOP2A的蛋白和mRNA表达.(4)治疗期间A于B、C、D,E与F、G、H,I与J、K、L组之间在各个体重监测点鼠重均值差异均没有统计学差异(P＞0.05);(5)用药结束后,D与C、F与E组相比,联合用药组小鼠移植瘤体积有明显增大,并且差异具有统计学意义(P＜0.05),说明过量的HSA明显抑制了DDP和VP-16化疗效果.(6)用药结束后,与对照组相比各化疗组的移植瘤重量明显降低,化疗药物与HSA联合用药组与相对应的化疗药物单独用药组相比,移植瘤重量明显增大,差异具有统计学意义(P＜0.05).比较各HSA联合用药前后两药的联合效应,说明HSA削弱了化疗药物效果. 结论：我们的研究结果表明,合并过量的HSA可能会削弱DDP/VP-16的抗癌作用,其机制可能是通过上调ERCC1和TOP2A表达来调控的.