奶牛黏附分子MadCam-1基因的克隆及原核表达

摘要

原核表达MadCam-1基因、纯化MadCam-1黏附蛋白，并制备其多克隆抗体，为进一步功能研究奠定基础。根据MadCam-1的已知基因序列设计并合成一对引物，应用PCR技术扩增MadCam-1基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中，构建重组表达质粒pGEX-4T-1-MadCam-1，转化入E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导，对其产物进行SDS-PAGE分析和Western-blotting鉴定，以纯化后的融合蛋白为抗原，免疫家兔，获得抗血清。结果表明，重组表达质粒pGEX-4T-1-MadCam-1经PCR及双酶切鉴定证明构建正确，测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100％。表达产物经Western-blotting鉴定，结果证实成功表达了分子质量约为50 ku的蛋白质。纯化的蛋白质免疫家兔后，经ELISA检测多克隆抗体效价为1:32000。因此，成功获得了奶牛MadCam-1多克隆抗体，为进一步研究奶牛黏附分子MadCam-1的功能奠定了基础。