丹参体内诱导移植骨髓间充质干细胞神经性分化及分化后神经生理功能研究

摘要

目的探讨丹参是否能提高骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)移植后神经性分化效率，移植分化后的细胞是否具有神经突触循环功能，MSC移植后是否可促进内源性神经干细胞(Neural stem cells，NSC)的分化。方法对6日龄新生大鼠腹腔注射5-溴脱氧尿苷嘧啶(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)以标记内源性NSC，于7日龄时制备为缺氧缺血性脑病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)动物模型，体外培养MSC，选取4～5代状态好的MSC用DAPI进行标记，于新生鼠发生HIBD后2 h进行腹腔注射移植。移植4周后进行Morris水迷宫学习记忆功能检测，水迷宫检测结束后BrdU／DAPI／Nestin，BrdU／DAPI/TUJ1，BrdU／DAPI／GFAP组织免疫荧光三标检测BrdU+细胞分化效率以及MSC分化效率，同时对移植分化后的细胞神经突触循环功能进行检测。结果MSC移植4周后Morris水迷宫检测结果显示：在定位航行实验中假手术正常对照组(A组)，HIBD后2 h接受MSC移植治疗，并于24h后接受丹参干预组(B组)，HIBD后2 h接受MSC移植治疗，并于24h后PBS对照干预组(C组)，HIBD后2 h接受丹参干预，并同时接受MSC移植治疗组(D组)，HIBD后2b接受丹参干预组(E组)，HIE空白对照组(F组)逃避潜伏时间分别为(s)：18．16±1．90、19．43±2.07、22．84±1．97、31.05±4.09、33．60±3．30、60．63±5．66，A组逃避潜伏时间明显低于C组、D组、E组、F组，P<0.05，与B组比较无明显差异，P>0.05：B组逃避潜伏时间明显低于D组、E组、F组，P<0.05;C组与A组、D组、E组、F组比较具有显著性差异，P<0.05，与B组无明显差异，P>0.05;D组与A组、B组、C组、F组比较具有显著性差异，P<0.05，与F组无明显差异，P>0.05;E组与A组、B组、c组、F组比较具有显著性差异，P<0.05;F组逃避潜伏时间明显高于其它各组，P<0.05。在空间探索实验中A组、B组、c组，D组、E组、F组的平台象限泳距占总泳距的比例分别为：0．62±0.03、0．63±0.04、0．57±0.07、0．48±0.03、0．45±0.02、O．31±0.03，A组和B组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于其他各组，P<0.05，A组与B组间无明显差异，P>0.05;C组平台象限泳距占总泳距的比例明显高于D组和E组，P<0.05;D组与E组间无明显差异，P>0.05，但明显高于F组，P<0.05。脑组织免疫荧光三标结果显示：A组、B组、C组，D组、E组、F组中BrdU+细胞Nestin表达率分别为(％)：78.04±6.03、23．43±3．57、33．73±3．69、43.01±5．45、48．59±5．45、65．63±7．20，B组BrdU+细胞Nes血的表达明显低于其他各组，P<0.05;A组与F组明显高于其他各组，P<0.05，F组明显低于A组，P<0.05：C组明显低于A组、D组、E组、F组，P<0.05;D组和E组间无显著性差异,P>0.05;A组、B组、C组，D组、E组、F组中BrdU+细胞GFAP表达率分别为(％)：11．71±3．28、26．85±3．22、24．87±3．17、23．62±2．74、21．70±3.08、18．27±3．86，B组、C组、D组、E组、F组BrdU+细胞GFAP表达率均较A组明显升高，P<0.05;A组、B组、C组，D组、E组、F组中BrdU+细胞TUJ1表达率分别为(％)：4．68±1．67、35.04±3．65、27．48±4．25、22．61±2．74、19．18±1．96、7．72±2．10，各组间BrdU+细胞TUJ1表达率比较均有显著性差异，P<0.05，B组>C组>D组>E组>F组>A组。B组、C组，D组MSC的TUJ1表达率分别为：0．59±0.07、0．28±0.07、0．23±0.03，各组间均具有显著性差异，P<0.05，B组>C组>D组，GFAP的表达率分别为：0．12±0.03、0．23±0.04、O．17±0.03，各组组间两两比较具有显著性差异，P<0.05，C组>D组>B组，Nestin的表达率分别为;0．12±0.04、0．23±0.06、0．23±0.04，B明显低于C组和D组，P<0.05，C组与D组间无明显差，P>0.05。MSC移植入HIBD新生鼠脑内5周后，突触循环检测结果显示：脑组织片第1次受到含10 μM SynaptoRed-C2荧光探针的50 mM K+刺激后，细胞发生胞吞作用而发出红色荧光，当再次受50 mM K+刺激后,细胞荧光强度降低。结论丹参可促进诱导移植的MSC体内神经性分化，分化的的细胞具有正常的突触循环功能，MSC的移植还可促进BrdU+细胞神经性分化。