乳兔窦房结细胞的分离、培养及鉴定

摘要

目的:窦房结是心脏传导系统中的重要组成部分,为心脏的正常起搏点,其病变可导致各种类型的心率失常.但由于研究方法有限,目前窦房结病变机制尚不明确,为从细胞水平深入研究SNC 的形态特征及电生理特性,本实验探讨适用于膜片钳技术的乳兔窦房结细胞(sinus node cell,SNC)的分离、纯化、培养方法,及采用全细胞膜片钳技术记录单个SNC 的动作电位进行鉴定.方法:选用新生新西兰乳兔5只,消毒后仰卧位将四肢固定于无菌泡沫上,在解剖显微镜下剪取于界嵴中部静脉窦侧、前腔静脉根部取2mm×2mm×2mm的组织块于DMEM中,先采用胶原酶Ⅱ型消化1次,再采用胰酶对SNC 进行逐次时间递减法消化分离,后将分离的细胞进行过滤以去除细胞液中的组织块,后将过滤的液体离心、重悬,再差速贴壁1.5h,结合Brdu对分离的细胞进行纯化培养,电镜下观察SNC形态变化,并采用全细胞膜片钳技术对单个光滑度高、活性好、表面干净的SNC进行动作电位的记录.结果：乳兔SNC位于上下腔静脉与右心耳交界处，呈倒置的三角形，培养的SNC主要有3种形态:梭形、三角形与不规则形，其中梭形细胞最多(61.5±6.8)%，搏动频率最快(136±12)次/min。全细胞膜片钳技术检测窦房结细胞动作电位，记录的10个梭形细胞的动作电位中平均最大舒张电位为(-50.9±5.3 mV)，动作电位幅度为(61.9±4.8 mV)。