人皮肤汗腺细胞提取液诱导hMSCs定向分化的研究

摘要

目的:探讨用汗腺细胞提取液在体外直接诱导成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)转分化为汗腺细胞的技术。 方法：体外分离和培养hMSCs,分别加入不同条件培养基进行成脂胁细胞、成骨细胞和成软骨细胞诱导分化，并以免疫组织化学染色(IC)和流式细胞仪(FACs)检测hMSCs抗原表达。利用Ⅱ型胶原酶消化皮肤标本，分离培养原代人皮肤汗腺细胞，液氮速冻和超声裂解后收集上清制备汗腺细胞(5×107个/ml)提取液并加入生成ATP成分(1mM ATP,1mN GTP,1mN NTP,10nM磷酸肌酸,25μg/ml肌酸激酶)，在800 ng/ml链球菌溶血素O(streptolysin O，SLO)可逆性通透处理hMSCs细胞1小时后,与汗腺细胞提取液孵育4小时,换用DMEM培养基诱导培养，对照组为单纯汗腺细胞提取液孵育组和单纯SLO处理组。培养3天后应用FACs、IC、和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)以及蛋白印迹(Western blot)检测培养细胞的汗腺特异标志，癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白8(CK8)、CK18、CK19抗原表达。 结果：hMSCs经加入不同条件培养基诱导后可以分化为脂肪细胞、成骨细胞和软骨细胞。CD29、CD44、CD90、和CD106抗原表达阳性，CD31、CD34、CD45和CD49b抗原表达阴性。FACs检查示SLO处理+汗腺细胞提取液孵育组与汗腺细胞提取液孵育组和SLO处理组比较，hMSCs细胞CEA阳性率分别为((85.74±2.53)%)，对((71.36±1.04)%和(1.63±1.58)%))(P<0.05)，CK8阳性率((82.46±2.85)%)对((3.54±1.92)%)和((1.03±1.58)%)(p<0.05).CK18阳性率((87.14±1.43)%)，对((4.25±1.02)%)和((1.92±0.46)%)(P<0.05)，CK19阳性率((90.65±1.63))对((3.20±1.14)%)和((2.82±0.65)%)(P<0.05)，IC态学染色显示诱导的hMSC3抗CEA、CK8、CK18、CK19染色均呈阳性表达，RT-PCR和Westernblot表明诱导的hMSCs细胞表达CEA、CKS、CK18、CK19基因和蛋白。 结论：汗腺细胞核酸提取液与SLO通透处理的hMSCs孵育1小时后.可以在体外诱导hMSCs转分化为汗腺细胞表型。