复方藤梨根制剂体外对MDR细胞株K562/ADR和K562/VCR细胞积聚和外排阿霉素(ADR)的影响研究

摘要

肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance， MDR)现象长期以来是肿瘤化疗过程中的一个棘手问题，是恶性肿瘤治疗中的一大障碍.复方藤梨根制剂为复方中药制剂，我们临床发现它对恶性肿瘤的化疗有一定的增敏、减毒作用，但其增敏作用机制不清.为此，本文进行了研究.本研究选用典型MDR细胞K562/ADR和K562/VCR耐药株(其耐药性可被Pgp抑制剂维拉帕米逆转).实验中，先采用MTT法，测试复方藤梨根制剂对三株细胞的毒性作用，取其半数抑制剂(IC50)以下的四个浓度组:2.5、5、10、20(mg/ml)，以维拉帕米作为阳性对照，观察其对耐药细胞是否具有逆转作用.取具有一定逆转作用的浓度组，运用流式细胞技术，测定复方藤梨根制剂对耐药细胞积聚和外排阿霉素(ADR)的影响程度. 方法: 1.细胞培养: 细胞K562、K562/ADR、K562/VCR常规培养于RPMI-1640完全培养液中(含15％小牛血清，青霉素100u/ml，链霉素100u/ml). 2.细胞抗药性试验--MTT法:取对数生长期细胞接种于96孔培养板内，每孔1×104(100ul/孔)，分别加入抗癌药或复方藤梨根制剂(FFTLG)、VCR(100ul/孔)，置于二氧化碳孵箱中， 37°C，培养72h后，按MTT法，用VICT0R 1420 MULTILABEL COUNTER比色计570nm波长处比色，求出半数抑制浓度IC50及抗药倍数(Resistant Factor， RF). 3.细胞抗药性逆转试验: 方法与细胞抗药性试验相同，只是在加入抗癌药物前15 min 分别加入VER(6ug/ml或 3ug/ml)、复方藤梨根制剂(FFTLG)2.5-20mg/ml，分别计算逆转倍数(Reversal Index， RI)，实验重复三次. 4.细胞内药物的积聚:将1×106/ml细胞与ADR(10ug/ml)，37°C，120min，收集细胞，配成1×106/ml细胞悬液用FACScan流式细胞仪(FCM)测定细胞内ADR荧光强度，以其荧光强度任意单位表示相对细胞内ADR浓度，实验重复三次. 5.复方藤梨根制剂对细胞内药物积聚的影响:实验步骤与测定细胞内药物的积聚试验基本相同，只是在加入ADR前15min，加入各种浓度的逆转剂. 6.多方藤梨根制剂对细胞内药物外排的影响:将1×106/ml细胞与ADR(10ul/ml)， 37°C，120min，用加入复方藤梨根制剂后，分别在0 min、15min、30min、60min、90min时点，用FCM测定细胞内ADR荧光强度，方法同上. 7.测定给药处理后24h、48h、72h后两耐药细胞株P-gp表达量流式细胞仪法: 取对数生长期细胞接种于24孔培养板二块，每孔1×105(l ml /孔)分别加入复方藤梨根制剂终浓度20mg/ml(1ml)VER终浓度6.ug/ml(1ml)空白对照组加1ml培养液(置于37°C，5％CO2培养箱内)每组设9孔，24h后各组取3孔，(105个细胞/孔)处理测定P-gp含量(上流式细胞仪测定)，计录结果.48h、72h后处理经过同上. 8.统计学处理:均数比较用t检验. 结果: 1.复方藤梨根制剂10mg/ml和20mg/ml浓度可部分恢复K562/ADR耐药细胞对ADR的敏感性，逆转倍数(RI)分别为7.53和10.31倍，与阳性对照组相似. 2. 复方藤梨根制剂20mg/ml浓度可部分恢复K562/VCR耐药细胞对ADR的敏感性，RI为6.18倍，与阴性对照组比较，差异显著(P＜0.05). 3. 10mg/ml和20mg/ml浓度的复方藤梨根制剂可增加K562/ADR和K562/VCR耐药细胞内ADR的积聚，其中对K562/ADR和K562/VCR耐药细胞株分别增加了77.6％、80.1％、和50.9％、45.2％，与未经处理的阴性对照组比较，差异显著(P＜0.05＝. 4. 复方藤梨根制剂10mg/ml和20mg/ml浓度对K562/ADR细胞外排ADR有一定影响，外排90min，细胞内残留分别达93.1％、92.3％，与VER相似(92.3％).而对K562/VCR细胞外排的影响稍差，细胞内残留分别达82.2％、86.9％. 结论: 复方藤梨根制剂 1.可部分逆转K562/ADR、K562/VCR耐药株对ADR的抗药性，但对VCR抗药性的作用不明显. 2.可增强MDR细胞K562/ADR和K562/VCR耐药株对ADR的摄取. 3.可减缓MDR细胞K562/ADR和K562/VCR耐药株外排ADR.