万古霉素糖基转移酶GtfE在雷莫拉宁产生菌中的异源表达与鉴定

摘要

雷莫拉宁(Ramoplanin)属于糖肽类抗生素,能够抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌,并且因为其具有独特的化学结构、强大的抗广谱革兰氏阳性菌的功效和暂无对其耐药的报道,而越来越受到人们的关注,目前已经进入Ⅲ期临床研究。万古霉素糖基转移酶GtfE在万古霉素生物合成途径中负责催化活性葡萄糖连接至万古霉素苷元,已有文献报道其具有良好的底物宽泛性,能够识别非天然糖受体与非天然糖供体,获得糖基多样性的化合物。本研究将万古霉素糖基转移酶GtfE在无糖雷莫拉宁产生菌中进行体内表达,通过体内转糖反应,以期获得雷莫拉宁。本研究从万古霉素产生菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中PCR扩增万古霉素糖基转移酶基因片段,同时用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切pSP72质粒,用SacⅠ和XbaⅠ双酶切得到扩增的gtfE基因片段。然后酶切,对酶切回收后得到的三个片段进行连接,得到带有红霉素启动子的pSP72质粒,命名为pWYX12-3-31.从pWYX12-3-31中用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切,同时用EcoR I和XbaⅠ双酶切pSET152质粒。再次酶切,对酶切回收后得到的两个个片段进行连接,得到带有红霉素启动子与gtfE片段的pSET152质粒,命名为pWYX12-4-12,基因测序结果与标准序列完全一致,电泳检测质粒构建成功。用pWYX12-4-12转化E.coli ET12567的感受态细胞得到转化菌株。此时含有质粒pWYX12-4-12的E.coli ET12567菌株作为供体菌株,与无糖雷莫拉宁产生菌(Actinoplanes CJS1001)进行接合转移,得到阳性接合子。获得突变株mWYX-dRE,首先验证其基因型正确,接着在其RNA转录水平进一步验证,电泳结果均显示正确,确定了GtfE基因在无糖雷莫拉宁产生菌中的成功表达,然后进行突变株发酵培养。经HPLC检测处理过的发酵液,发现突变株mWYX-dRE有新的化合物产生,命名为RW,对突变株mWYX-dRE发酵产物进行分离纯化后,得到液相纯度达到95％以上的RW样品进行初步结构鉴定,经LC-MS检测中发现信号m/z ([M+2H]2+)=1278,计算MASS为2554,同时LC-MS检测无糖雷莫拉宁产生菌发酵产物中不存在这一新的化合物,以上结果表明,万古霉素糖基转移酶GtfE能够在无糖雷莫拉宁产生菌中进行异源表达,并生成了新的化合物RW,因在液相条件下检测结果与A2的一致,且经过LC-MS检测分子量相同,推测可能是雷莫拉宁A2或者是其类似物,工作为今后深入研究新的化合物的生成提供了新的思路。