中国地方黑猪血液红细胞源抗菌肽的纯化及活性鉴定

摘要

分离纯化中国地方黑猪血液红细胞中的抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)并对其体外抗菌活性进行初步分析。以中国地方黑猪血液为材料,于4℃700×g离心15 min,弃去上层液,用灭菌生理盐水洗涤红细胞,重复3次,再用0.83％氯化铵溶液溶解红细胞(比例为3:1),然后于4℃700×g离心15 min去除白细胞,将含血红细胞裂解的溶液经冷冻干燥,冻干物即为猪红细胞抗菌肽粗提物。通过离子交换层析法纯化抗菌肽粗提物,进样速度20 mL/h,用25 mmol/L乙酸铵洗去非阳离子成分、10％乙酸洗脱阳离子成分。紫外分光光度检测器在230 nm处监测其吸光度。收集洗脱峰(5 mL/管),冻干后用0.01％乙酸重悬。再用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)进一步纯化分离有活性的阳离子峰抗菌肽,用梯度为30％～35％的乙腈和0.1％三氟乙酸进行洗脱。缓冲液A:5％乙腈,0.1％三氟乙酸;缓冲液B:95％乙腈,0.1％三氟乙酸。A到B的梯度为30％～35％,时间为80 min.用紫外分光光度计检测器在215 nm处监测其吸光度,收集峰液,冻干,用0.01％乙酸溶解。用双层琼脂糖弥散法测定其对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等受试菌株抗菌活性。结果表明,通过离子交换层析获得的阳离子峰有抗菌活性,通过RP-HPLC对阳离子峰纯化后获得了6个峰;6个峰液对大肠杆菌和沙门氏菌均具有抗菌活性,峰液F1、F2和F3对金黄色葡萄球菌具有抗菌活性,仅峰液F1对白色念珠菌具有抗菌活性。本试验首次从中国地方黑猪红细胞中的分离出来具有抗菌活性的物质,为进一步研究猪红细胞源抗菌肽奠定基础。