猪圆环病毒2型单克隆抗体研制与夹心ELISA抗原检测方法的建立

摘要

猪圆环病毒2型(PCV2)是影响世界养猪业经济损失的重要致病原之一。本研究利用纯化的猪圆环病毒2型(PCV2)免疫Balb/c小鼠,通过单克隆抗体技术,筛选获得3株能稳定分泌抗PCV2-Cap蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3E5、3E6和5A6.体外培养连续传代至第20代,分泌抗体的效价基本一致。3E5、3E6和5A6培养的上清效价分别为1:12800、1:1600和1:6400,腹水效价为1:6400000、1:640000和1:800000;3株单抗亚类鉴定,重链均为IgG2a型,轻链为κ型;间接免疫荧光试验结果显示,3株单抗均可与PCV2毒株产生特异性荧光反应;病毒中和试验结果为,3E5和3E6均具有良好的中和活性,而5A6不具有中和活性;Western blot结果表明,3株单抗均能与纯化PCV2 Cap蛋白(约30kDa)发生特异性反应,其识别的表位需要Cap蛋白N端42-50aa区域的参与。利用PCV2单克隆抗体3E5作为捕获抗体，兔抗PCV2血清为第一抗体，成功建立了PCV2夹心ELISA抗原检测方法。该方法与猪圆环病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪巨细胞病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪脑心肌炎病毒及副猪嗜血杆菌等均无交叉反应性。检测PCV2细胞毒，其最低检测下限为102.59TCID50/mL;批内和批间试验变异系数均小于10%。采用倍比稀释PCV2标准样品绘制病毒抗原定量检测的标准曲线，检测范围为390.6～25000TCID50/mL，相关系数r值为0.99。该方法与经β丙内酯灭活的PCV2细胞毒、真核表达的PCV2 Cap蛋白均可有效反应，但不能与甲醛灭活的PCV2抗原反应。应用该方法定量检测6份细胞毒样品中PCV2含量，结果与间接免疫荧光法测得的病毒TCID50相似;用该方法检测临床发病猪淋巴结组织样品中PCV2含量，发现仔猪表现PMWS的临床症状与其组织中PCV2的病毒含量有明显的正相关性。以上结果表明该方法在应用于PCV2含量检测和PCVAD诊断方面，具有重要应用前景。