新城疫HN蛋白的表达、纯化及其在新城疫抗体检测中的应用

摘要

本研究通过生物信息学方法分析NDVxx08株基因组特征,选取HN蛋白主要抗原区设计引物,利用PCR技术扩增出HN片段主要抗原区(Ile175-Lys367),将该基因片段克隆于pMD 18-T-simple载体,构建重组克隆载体pMD-HnIleNLy.,鉴定并测序后构建HneNLys原核重组表达载体pET32-HneNLys,将其转化至Rosetta (DE3)表达菌株中,对IPTG浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,以确定该蛋白最适表达条件,并通过SDS-PAGE和Western-blot对蛋白产物进行分析和抗原性进行鉴定.以最适诱导条件对HneNLys表达菌体进行诱导并收集上清,并通过Ni-NTA亲和树脂对目的蛋白进行纯化.利用纯化获得的HⅡeNLys、重组蛋白作为包被抗原，通过优化最适抗原包被浓度、待检血清最适稀释比例，建立NDV血清抗体效价的间接ELISA检测方法。利用本研究所建立的检测方法对40份NDV临床阳性血清、10份NDV临床阴性血清、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡禽流感病毒的标准阳性血清进行检测，并与血凝抑制实验(HI)结果进行比较，确定所建立检测方法的敏感性和特异性。实验结果表明，pET32-HⅡeNLys、表达菌体在28℃,IPTG 0.2mmol/L诱导4个小时获得高效表达，且通过SDS-PAGE和Western-blot分析，所获得HⅡeNLys重组蛋白分子量为38ku，并能够与鸡抗NDV高免血清发生特异性反应，具有良好的免疫学活性，能够作为包被抗原用于新城疫抗体效价检测。NDV血清抗体效价间接ELISA检测方法建立结果表明，HⅡeNLys重组蛋白作为包被抗原最适浓度为5μL/ml，检测血清最适稀释比例为1:20。以血凝抑制效价24为阳性判断标准，所建立方法对血清样本检测临界值为0.185。利用所建立的NDV血清抗体效价间接ELISA方法对40份NDV临床阳性血清和1O份NDv临床阴性血清进行检测，与血凝抑制实验(HI)比较其阳性符合率能达到88%,阴性符合率为100%，无假阳性检测结果，并与鸡传染性法氏囊病毒，鸡传染性支气管炎病毒，鸡禽流感病毒等标准阳性血清无交叉反应。本研究建立的检测新城疫抗体的间接ELISA方法具有简单、快速，特异性强等优点能够用于鸡新城疫抗体水平的快速检测。