阴沟肠杆菌B8拮抗活性相关基因的克隆与分析

摘要

为研究具有广谱拮抗活性的阴沟肠杆菌B8的拮抗机理,应用自杀性质粒pZJ25介导,将Tn5转座到B8的染色体上,筛选到两株拮抗活性丧失的菌株.选择其中B8F突变株,应用Tn5上的Kan抗性基因作为标签,对Tn5插入位点左侧的拮抗活性相关基因片段进行了克隆,筛选得到质粒pTLF,经亚克隆后测序,获得F片段735bp的序列.提取原始菌株B8基因组DNA,酶切后与Sau3A I和Pst I两种接头连接,应用两种接头配套的引物和根据F片段设计的特异引物PCR扩增,进行染色体步行,获得了Tn5插入位点右侧的1106bp序列.生物信息学分析显示:获得的B8菌株拮抗相关基因序列包含3个ORF,与Pantoea agglomerans的andrimid生物合成基因簇(AY192157)有较高的同源性,分别对应于AdmM、AdmN和AdmO三个基因.被Tn5插入破坏的ORF(命名为Anr-F基因)对应于AdmM(Polyketide合酶基因),插入位点位于终止密码前214bp处.由此证明Anr-F基因与B8菌株的拮抗活性相关,推测B8菌株产生的拮抗物质为Andrimid.