荧光实时定量PCR检测铜绿假单胞菌外膜蛋白 oprⅠ基因的标准品的构建

摘要

目的：构建荧光实时定量PCR(FQ-PCR)标准品测定铜绿假单胞菌oprⅠ基因,以此测定铜绿假单胞菌菌量. 方法：以铜绿假单胞菌的oprI基因为目的基因设计探针引物,提取细菌基因组DNA,与pMD18-TVector连接并转化到大肠杆菌中.用氨卞青霉素筛选出白色菌落,提取含目的基因质粒,并用HindⅢ限制酶进行线性化处理,通过直接PCR、OD值测定及DNA片段测序鉴定其特异性.根据OD值确定浓度,制备FQ-PCR梯度浓度参考标准品,做出标准曲线,检测各样品菌菌量. 结果：铜绿假单胞菌oprI基因的目的片段成功制备,获得稳定的重组质粒,保持了目的片段的特异性和序列完整性,并获得很好的标准曲线(相关系数0.994),成功检测了铜绿假单胞菌标准菌株、培养株的菌量,而大肠杆菌及阴性对照无扩增. 结论：成功构建FQ-PCR检测铜绿假单胞菌oprⅠ基因的定量参考标准,荧光实时定量法可以快速检测铜绿假单胞菌.